LIM轉(zhuǎn)錄因子(Oslim)參與水稻非寄主抗性的功能分析.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆反應(yīng)、防衛(wèi)反應(yīng)等生物學(xué)過程,是調(diào)控一系列基因表達(dá)的重要因子。LIM轉(zhuǎn)錄因子是指含有LIM結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,在高等生物中廣泛存在,參與基因轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架建成等生物學(xué)過程。
　　 為了研究LIM轉(zhuǎn)錄因子在水稻非寄主抗性中的作用,本論文以水稻品種日本晴為材料,根據(jù)LIM轉(zhuǎn)錄因子編碼基因Oslim(LOC_Os03g42820)的序列,利用特異性引物克隆了Oslim片段,并構(gòu)建了該基因的RNA干擾

2、載體；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻,獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株；利用PCR檢測和GUS染色檢測選擇出轉(zhuǎn)基因陽性植株,并利用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株中Oslim的表達(dá)水平；最后,對轉(zhuǎn)基因陽性植株接種非寄主菌(辣椒斑點(diǎn)病菌,Xanthomonas campestris pv.vesicatoria),進(jìn)行抗病性鑒定,分析Oslim的功能。本實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果如下:
　　 (1)Oslim片段的克隆。以水稻品種日本晴葉片cDNA為模板,利用

3、設(shè)計(jì)的特異性引物,克隆得到了Oslim片段并測序,將測得的序列與水稻轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中的該基因序列(LOC_Os03g42820)進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)二者的相似性達(dá)到了98％,表明己成功克隆Oslim片段。
　　 (2)RNA干擾載體的構(gòu)建。將克隆的Oslim片段正向、反向連入pTCK303干擾載體,獲得了Oslim的RNA干擾載體。通過酶切驗(yàn)證,證實(shí)了Oslim的RNA干擾載體構(gòu)建成功。
　　 (3)Oslim沉默的轉(zhuǎn)基因

4、水稻植株的獲得。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將Oslim的RNA干擾載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織基因組中。通過組織培養(yǎng),獲得了15株Oslim沉默的轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過PCR檢測和GUS染色法檢測,發(fā)現(xiàn)其中的13株為轉(zhuǎn)基因陽性植株。通過熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性植株中Oslim的表達(dá)水平顯著降低。
　　 (4)轉(zhuǎn)錄因子Oslim在植物防衛(wèi)反應(yīng)中的功能分析。對轉(zhuǎn)基因陽性水稻接種非寄主菌(辣椒斑點(diǎn)病菌,Xanthomonas campestr