小鼠胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞及細(xì)胞移植對(duì)肝損傷作用的研究.pdf

1、肝臟是動(dòng)物體內(nèi)最大的腺體,也是最重要的器官之一,肝臟的功能極為復(fù)雜,有體內(nèi)“化學(xué)工廠”之稱,所以肝臟一旦發(fā)病就嚴(yán)重威脅人類的身體健康,也是人類因疾病死亡的主要原因之一。目前人們對(duì)于各種原因?qū)е陆K末期肝病仍然沒(méi)有有效的治療措施,原位肝移植(orthotopic livet transplantation,OLT)成為了疾病治療最后的保障,然而由于肝臟供體來(lái)源的短缺和可能發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的限制,肝移植的應(yīng)用比較局限。肝細(xì)胞移植技術(shù)(hepa

2、toeyte transplantation,HCT)是繼原位肝移植技術(shù)后又一種治療各種終末期危重肝病的方法,而且相對(duì)于OLT更具有優(yōu)勢(shì),但同樣也面臨著細(xì)胞來(lái)源的問(wèn)題,而目前作為體外支持治療用的生物人工肝(bioartificial liver,BAL)也因?yàn)楦渭?xì)胞來(lái)源問(wèn)題而進(jìn)展緩慢,如何進(jìn)一步解決肝細(xì)胞的來(lái)源、數(shù)量和活力問(wèn)題成為了開(kāi)展HCT治療和BAL技術(shù)的核心問(wèn)題。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ES細(xì)胞)具有

3、無(wú)限增殖和三胚層多向分化的潛能,是再生醫(yī)學(xué)重要的種子細(xì)胞,為各種損傷及退行性疾病的細(xì)胞治療帶來(lái)了新的希望,建立有效的定向誘導(dǎo)分化技術(shù)用于損傷和疾病組織的修復(fù)和替代治療研究是目前ES細(xì)胞研究的重要方向。研究表明ES細(xì)胞可以在體內(nèi)外成功地分化為肝細(xì)胞,這對(duì)于各種終末期肝病的細(xì)胞治療提供了潛在無(wú)限的細(xì)胞來(lái)源,然而ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞的研究還處于初級(jí)階段,目前主要模擬肝臟發(fā)育的機(jī)制,通過(guò)相關(guān)細(xì)胞因子或化合物、基因修飾和共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)ES細(xì)胞

4、分化為肝細(xì)胞,技術(shù)復(fù)雜、分化效率低下、成本高。本研究使用小鼠胚胎干細(xì)胞系ES-D3細(xì)胞作為研究對(duì)象,建立了兩步法單層誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的方法,并對(duì)誘導(dǎo)分化所得的肝樣細(xì)胞從形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)、蛋白分子標(biāo)記及細(xì)胞功能等方面進(jìn)行了檢測(cè),證明了分化所得細(xì)胞為肝細(xì)胞,而且分化所得肝細(xì)胞脾臟移植到損傷小鼠肝臟后可以歸巢并整合到小鼠損傷肝組織內(nèi)；最后,利用建立的小鼠四氯化碳急性肝損傷模型,通過(guò)活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了人胎肝細(xì)胞系HL-7702作為生物

5、人工肝細(xì)胞來(lái)源的潛力。
　　 本研究共分為六個(gè)部分,第一、二和三部分進(jìn)行了小鼠胚胎干細(xì)胞系ES-D3細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化,并從細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、蛋白分子標(biāo)記及細(xì)胞功能方面進(jìn)行了全面檢測(cè),誘導(dǎo)分化所得細(xì)胞為肝樣細(xì)胞；同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)分化過(guò)程中,丁酸鈉導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象和細(xì)胞周期分布進(jìn)行了研究,表明EGF可以抑制細(xì)胞凋亡。第四部分通過(guò)灌胃的方法,建立了小鼠急性四氯化碳肝損傷模型；第五部分將體外DAPI標(biāo)記的分化所得的ES-D3-H

6、ep細(xì)胞通過(guò)脾臟注射的方法,移植到急性肝損傷小鼠體內(nèi),表明移植的ES-D3-Hep細(xì)胞可以整合到損傷的肝組織內(nèi)。第六部分利用建立的小鼠急性四氯化碳肝損傷模型,過(guò)腹腔移植人胎肝細(xì)胞HL-7702,表明其作為生物人工肝的細(xì)胞來(lái)源具有潛在的價(jià)值。主要的研究結(jié)果如下:
　　 第一部分在小鼠ES-D3細(xì)胞的培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察試驗(yàn)中,以小鼠胚胎干細(xì)胞系mESC-D3為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用KNOCKOUT-DMEM和KNOCKO

7、UT-SERUM REPLACEMENT建立了小鼠ES細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,結(jié)合明膠鋪被,初步建立了小鼠ES細(xì)胞無(wú)血清無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系,通過(guò)比較差速貼壁結(jié)合傳代和單純傳代對(duì)去除飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF的效果,結(jié)果表明,差速貼壁結(jié)合傳代去除飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF的效果好于單純傳代,為ES細(xì)胞后續(xù)誘導(dǎo)分化奠定了基礎(chǔ)。同時(shí),mESC-D3細(xì)胞通過(guò)兩階段單層誘導(dǎo)分化培養(yǎng)共19天,逐漸分化為肝樣細(xì)胞,光鏡和透射電鏡對(duì)分化細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的觀察表明,分

8、化所得細(xì)胞具有肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。
　　 第二部分對(duì)ES-D3細(xì)胞誘導(dǎo)分化所得的ES-D3-Hep細(xì)胞的一些標(biāo)志基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),同時(shí)對(duì)第一階段誘導(dǎo)分化過(guò)程中誘導(dǎo)分化劑丁酸鈉產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,分化所得的ES-D3-Hep細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞具有的標(biāo)志基因AFP、ALB、TTR和AAT,而自發(fā)分化組細(xì)胞只是微弱表達(dá)AFP和ALB,不表達(dá)肝細(xì)胞晚期標(biāo)志物TTR和AAT,提示誘導(dǎo)分化所得的ES-D3-H

9、ep細(xì)胞已經(jīng)具備肝細(xì)胞具有的基因表達(dá)特征,包含不同成熟階段的肝細(xì)胞。誘導(dǎo)分化7天,NaB引起細(xì)胞凋亡使大量細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期,而通過(guò)添加EGF,可以明顯降低S期細(xì)胞周期的比例,增加G0/G1期細(xì)胞的比例,抑制細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分對(duì)ES-D3細(xì)胞分化所得的ES-D3-Hep細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)重要標(biāo)志蛋白的免疫熒光分析,同時(shí)對(duì)其肝細(xì)胞功能進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示,ES-D3-Hep細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白ALB、AFP、CK

10、8和CK18,而自發(fā)分化組也有一些細(xì)胞表達(dá)ALB和AFP,但不表達(dá)CK8和CK18,誘導(dǎo)分化組肝細(xì)胞分化率分別為37.27％和41.67％,兩組間差異不顯著,和自發(fā)分化組比較,差異顯著。對(duì)ES-D3-Hep細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)肝細(xì)胞特異性功能檢測(cè),顯示誘導(dǎo)分化組細(xì)胞具有代謝ICG的細(xì)胞功能,而自發(fā)分化組只有少量細(xì)胞具有代謝ICG的細(xì)胞功能；PAS實(shí)驗(yàn)顯示ES-D3-Hep細(xì)胞具有合成糖原的細(xì)胞功能,而自發(fā)分化組細(xì)胞染色較少且淡染；這些結(jié)果表明分

11、化所得的ES-D3-Hep細(xì)胞具有肝細(xì)胞的特異蛋白分子標(biāo)記,同時(shí)又具備了肝細(xì)胞特異的細(xì)胞功能。
　　 第四部分通過(guò)灌胃的方法,通過(guò)觀察小鼠的行為狀態(tài)、統(tǒng)計(jì)死亡率、病理解剖觀察肝臟的病理變化、組織學(xué)觀察肝臟組織病理變化以及檢測(cè)血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性的改變,結(jié)果表明,5μl/g四氯化碳劑量灌胃的方法,可以建立穩(wěn)定的小鼠四氯化碳急性肝損傷模型。
　　 第五部分利用已經(jīng)建立的小鼠四

12、氯化碳肝損傷模型,通過(guò)脾臟注射的方法,將體外DAPI標(biāo)記的ES-D3-Hep細(xì)胞移植到急性肝損傷小鼠體內(nèi),觀察是否具有真正的支持肝臟代謝的功能。結(jié)果表明,ES-D3-Hep細(xì)胞經(jīng)DAPI標(biāo)記后,標(biāo)記率可達(dá)到100％,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)標(biāo)記后細(xì)胞活率與未標(biāo)記細(xì)胞相比沒(méi)有明顯差別,表明DAPI是一種良好的體外細(xì)胞移植示蹤標(biāo)記物；細(xì)胞移植后連續(xù)10天觀察小鼠的存活情況,細(xì)胞移植組存活率高于溶劑移植組,但差異不顯著；肝臟冰凍切片觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞移植可

13、以觀察到一些散在的藍(lán)色熒光點(diǎn),表明移植的ES—D3-Hep細(xì)胞可以整合到損傷的肝組織內(nèi)。
　　 第六部分利用建立的小鼠四氯化碳急性肝損傷模型,使用已經(jīng)建立的正常人胎肝細(xì)胞系HL-7702進(jìn)行腹膜腔移植,觀察對(duì)急性肝損傷是否具有代謝支撐功能。結(jié)果表明,細(xì)胞移植組(G1)的血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST在移植后第3天和第7天相對(duì)于空白對(duì)照組(G3)顯著升高(P<0.05),而相對(duì)于溶劑移植對(duì)照組(G2)顯著降低(P<0.05),而移植后1

14、4天,三組差異不顯著(P>0.05)。小鼠肝臟白蛋白ALB在移植后的第3天和第14天3組差異不顯著(P>0.05),而在移植后的第7天細(xì)胞移植組(G1)和空白對(duì)照組(G3)差異不顯著(P>0.05),但都與溶劑移植組(G2)差異顯著(P<0.05)。三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織學(xué)觀察表明,移植后第3天差異不顯著,都表現(xiàn)為嚴(yán)重的組織細(xì)胞壞死,而移植后第7天細(xì)胞移植組(G1)的損傷程度明顯輕于溶劑移植組(G2),到移植后第14天時(shí),存活小鼠肝臟組織學(xué)