仿刺參(Apostichorus japonicus)免疫增加劑的體外篩選與養(yǎng)殖試驗的評估.pdf

1、本文選擇我國重要的海水養(yǎng)殖動物仿刺參(Apostichopus japonicus)為研究對象，構(gòu)建仿刺參免疫增強劑體外篩選平臺。探討(1)不同種類免疫增強劑對刺參體腔細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響；(2)復(fù)合免疫增強劑對刺參體腔細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響及其養(yǎng)殖試驗的評估。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.選用初始體重為52.4士9.2g的健康成參A.japonicus為研究對象，對其體腔細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中添加β-葡聚糖、肽聚糖、殼聚

2、糖、甘露寡糖、乳鐵蛋白、CpG寡脫氧核苷酸、維生素C和維生素E。β-葡聚糖的添加濃度為0（對照組）、5、25和100μgml-1，肽聚糖的濃度為0（對照組）、2、10和50μgml-1，殼聚糖的濃度為0（對照組）、80、100和400μgml-1。添加甘露寡糖的濃度為0（對照組）、40、80和120μgml-1。添加乳鐵蛋白的濃度為0（對照組）、5、25和100μgml-1。添加CpG寡脫氧核苷酸的濃度為0（對照組）、0.5、2.5和5

3、μM。添加維生素C的濃度為0（對照組）、25、100和250μgml-1，維生素E的濃度為0（對照組）、20、40和100μgml-1。刺參體腔細(xì)胞在含有β-葡聚糖、肽聚糖、殼聚糖、甘露寡糖、乳鐵蛋白或CpG寡脫氧核苷酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1h、3h、6h、12h和24h后，在含有維生素C或維生素E的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3h、6h、12h、24h和48h后，取樣測定體腔細(xì)胞的免疫指標(biāo)，包括：吞噬率、超氧陰離子含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力和總一氧

4、化氮合成酶(T-NOS)活力。結(jié)果表明：β-葡聚糖和肽聚糖能夠顯著提高刺參體腔細(xì)胞的全部免疫指標(biāo)（P＜0.05），但存在高濃度的免疫抑制現(xiàn)象。甘露寡糖和CpG寡脫氧核苷酸能夠顯著提高刺參體腔細(xì)胞的4項免疫指標(biāo)（P＜0.05）。乳鐵蛋白能夠顯著提高刺參體腔細(xì)胞的超氧陰離子含量和SOD活力（P＜0.05），對吞噬率和T-NOS活力沒有顯著提高作用。維生素C和維生素E能夠顯著提高刺參體腔細(xì)胞的SOD活力和T-NOS活力（P＜0.05），但對吞

5、噬率和超氧陰離子含量沒有顯著影響。殼聚糖未對刺參體腔細(xì)胞的免疫指標(biāo)產(chǎn)生顯著性影響(P＞0.05)。可見，β-葡聚糖、肽聚糖、甘露寡糖、乳鐵蛋白、CpG寡脫氧核苷酸、維生素C和維生素E能夠直接提高刺參體腔細(xì)胞的免疫力，具有作為刺參用免疫增強劑的潛力。
　　 2.以初始體重(3.8±0.2g)的健康稚參A.japonicus為研究對象，探討復(fù)合免疫增強劑對刺參的影響。首先對刺參的體腔細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，實驗設(shè)計為兩因素三水平的(3×3

6、)的雙因子實驗，向培養(yǎng)液中添加β-葡聚糖濃度為0、10和25μg/ml，每種濃度分別與三種濃度的甘露寡糖（0、40和80μg/ml）進(jìn)行組合。以不添加任何免疫增強劑的實驗組為對照組。刺參體腔細(xì)胞在含不同濃度免疫增強劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1h、3h、6h、12h和24h后，取樣測定體腔細(xì)胞的免疫指標(biāo)。以吞噬活性、超氧陰離子含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力和總一氧化氮合成酶(T-NOS)活力為評價指標(biāo)。結(jié)果表明：復(fù)合添加β-葡聚糖和甘露寡糖與單

7、獨添加β-葡聚糖或甘露寡糖相比，能夠進(jìn)一步提高刺參體腔細(xì)胞的吞噬率、超氧陰離子含量、SOD和T-NOS活力，且能夠延長β-葡聚糖與甘露寡糖對細(xì)胞的免疫作用時間。在上述實驗的基礎(chǔ)上，又進(jìn)行了養(yǎng)殖試驗的驗證。以基礎(chǔ)飼料組作為對照組。實驗設(shè)計仍為為兩因素三水平的(3×3)的雙因子實驗。分別在每千克基礎(chǔ)飼料中單獨添加0mg、75mg、150mg的β-葡聚糖或再復(fù)合添加0mg、100mg、200mg的甘露寡糖。將健康刺參隨機分配到室內(nèi)海水循環(huán)系統(tǒng)

8、中的玻璃鋼桶(1501)中進(jìn)行養(yǎng)殖實驗，隨機分為9組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)放養(yǎng)45頭刺參。喂養(yǎng)刺參至第7天、11天、15天、18天、22天、25天和29天時，每個重復(fù)中隨機選取3頭海參，檢測其免疫指標(biāo)。養(yǎng)殖4周后，剩余的刺參進(jìn)行稱重，并注射燦爛弧菌Vibriosplendidus菌懸液進(jìn)行攻毒。結(jié)果表明：單獨添加β-葡聚糖或甘露寡糖能夠顯著提高刺參的生長率、免疫力和抗病力（P＜0.05）；復(fù)合添加β-葡聚糖和甘露寡糖相比單獨添加β-葡