CYP19和OSP-1卵巢特異表達啟動子克隆與檢測.pdf

1、組織特異表達的啟動子是轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)中的重要調(diào)控元件。本研究克隆了水牛、黃牛CYP19啟動子0.9k和1.6k各兩個片段，大鼠卵巢特異性啟動子(OSP-1)片段，并構(gòu)建了真核表達載體在細胞水平進行了檢測。參考GenBank發(fā)布的黃牛CYP19基因exon2序列和大鼠OSP-1序列，設(shè)計了3對特異性引物，以黃牛、水牛和大鼠基因組為模板，PCR擴增獲得5個相應(yīng)長度的啟動子片段，經(jīng)克隆、測序和序列比對發(fā)現(xiàn)，水牛和黃牛相應(yīng)片段與已知序列的相似性

2、分別為95％、99％，大鼠的為96％，初步證明獲得的片段為預(yù)期設(shè)計的啟動子區(qū)。雙酶切將5個啟動子片段定向克隆到去除CMV的pEGFP-N1載體，構(gòu)建成5個真核表達載體pHCYP19-0.9-EGFP-N1、pSCYP19-0.9-EGFP-N1、pHCYP19-1.6-EGFP-N1、pSCYP19-1.6-EGFP-N1和pOSP-1-EGFP-N1.
　　 應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)將載體分別轉(zhuǎn)染水

3、牛的顆粒細胞、乳腺上皮細胞和胎兒成纖維細胞，并于轉(zhuǎn)染后12h，24h和48h在熒光顯微鏡下觀察EGFP表達情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pOSP-1-EGFP-N1的水牛顆粒細胞，12h后可觀測到EGFP的表達，24h后表達EGFP的細胞增多，48h后EGFP表達的細胞數(shù)量驟減。轉(zhuǎn)染pHCYP19-0.9-EGFP-N1和pSCYP19-0.9-EGFP-N1的顆粒細胞，僅在轉(zhuǎn)染后24h觀測到少量表達EGFP的細胞，且熒光較弱，48h后基本觀察不

4、到EGFP表達的細胞；轉(zhuǎn)染pHCYP19-1.6-EGFP-N1和pSCYP19-1.6-EGFP-N1載體后沒有觀察到EGFP表達的細胞，5種載體轉(zhuǎn)染乳腺上皮細胞和胎兒成纖維細胞，均未觀察到EGFP表達的細胞。結(jié)論：(1)應(yīng)用PCR擴增獲得了黃牛CYP19啟動子(935 bp，1571bp)，水牛CYP19啟動子(945bp，1586bp)和大鼠OSP-1啟動子(480bp)片段；(2)其中黃牛、水牛的CYP19啟動子(0.9k)和大