PRRSV感染激活RANTES產(chǎn)生的信號(hào)通路研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起，臨床上表現(xiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎，提示炎癥因子在PRRSV的致病中扮演著十分重要的角色，但其作用的分子細(xì)節(jié)尚不十分清楚。趨化因子RANTES是一種重要的炎癥因子，能高效趨化T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞，調(diào)節(jié)白細(xì)胞移行到感染部位，從而參與激活免疫反應(yīng)。但RANTES與PRRSV感染之間的關(guān)系尚不清楚，鑒于此，本課題開展了PRRSV感染細(xì)胞后RANTES的表

2、達(dá)以及PRRSV調(diào)控RANTES表達(dá)信號(hào)通路的研究。具體內(nèi)容如下：
　　 1.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞激活RANTES利用熒光定量RT-PCR和RANTES啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，于感染后不同時(shí)間檢測(cè)RANTES的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞顯著上調(diào)RANTES基因的轉(zhuǎn)錄，且呈感染時(shí)間和感染劑量依賴性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，紫外滅活的PRRSV不能激活RANTES，提示PRRSV激活RANTES與PRRSV

3、的增殖密切相關(guān)。
　　 2.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞激活RANTES與NF-κB密切相關(guān)利用RANTES啟動(dòng)子各轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失突變體的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)核因子κB(NF-κB)在PRRSV感染激活RANTES中起最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，干擾素刺激反應(yīng)元件ISRE不參與RANTES基因的轉(zhuǎn)錄，而CRE和NF-IL6位點(diǎn)對(duì)PRRSV激活RANTES的作用不顯著。為了證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在PRRSV感染激活RANTES

4、中的關(guān)鍵作用，進(jìn)一步利用NF-κB抑制劑BAY11-7082處理細(xì)胞或以IκB的負(fù)調(diào)控突變體(mIκBα)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果均能顯著抑制PRRSV誘導(dǎo)的RANTES基因轉(zhuǎn)錄，.說明NF-κB信號(hào)通路確實(shí)參與PRRSV誘導(dǎo)RANTES。
　　 3.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞激活RANTES的上游信號(hào)通路分析為了揭示PRRSV感染激活RANTES產(chǎn)生的上游信號(hào)通路，以MAPK通路的反式激活質(zhì)粒pFA2-ELK1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，

5、證實(shí)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞能激活MAPK通路。進(jìn)一步采用ERK1/2、p38和JNK這3條MAPK通路的抑制劑分別處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK1/2抑制劑U0126呈濃度依賴性下調(diào)RANTES基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染ERK負(fù)調(diào)控突變體也得到了相同的結(jié)果，表明ERK1/2通路參與了PRRSV誘導(dǎo)RANTES的產(chǎn)生。同時(shí)，對(duì)NF-κB的兩條上游信號(hào)通路TLRs、RIG-Ⅰ的主要接頭蛋白(MyD88、TRIF、TRAF6、RIG-Ⅰ、TRAF