中華絨螯蟹cDNA文庫的構建及免疫相關基因的克隆與表達.pdf

1、中華絨螯蟹是我國具有重要經濟價值的水產品。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大及環(huán)境的惡化，各種由細菌、病毒和寄生蟲等病原引起的疾病頻繁發(fā)生，給中華絨螯蟹的養(yǎng)殖帶來了巨大經濟損失。本研究借助分子生物學手段，首先通過構建脂多糖刺激的中華絨螯蟹cDNA文庫，在此基礎上，篩選出一些與免疫相關的基因序列，并通過cDNA末端快速擴增(RACE)和實時熒光定量PCR技術進一步對主要免疫相關基因進行了克隆和表達分析，為中華絨螯蟹的免疫機制提供基礎資料。結果

2、如下：
　　 1.運用SMART技術成功構建了庫容量為6.28×106，重組率為95.8％，平均插入片段為700bp的脂多糖刺激的中華絨螯蟹cDNA文庫，從文庫中挑取cDNA克隆進行測序，總共進行了319個成功反應，獲得140個包含重疊群的表達序列標簽(EST)，使用BLAST軟件將這些序列同GenBank等數據庫進行比對、查詢和注釋，結果顯示121條序列有相關同源性，獲得了一些會在中華絨螯蟹的免疫反應中起著重要作用基因的EST

3、s，為中華絨螯蟹免疫相關基因的深入研究奠定了基礎。
　　 2.C型凝集素是一個具有糖識別結構域的超家族，在無脊椎動物的先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。在前期構建中華絨螯蟹cDNA文庫時獲得的兩個C型凝集素的EST序列的基礎上，采用RACE方法擴增了這兩個基因的cDNA序列。中華絨螯蟹C型凝集素A(EsLecA)其全長為772bp，包含462bp的開放閱讀框，推測編碼的蛋白質為153aa，其5′和3′端的非編碼區(qū)分別為175bp和135

4、bp；C型凝集素B(EsLecB)其全長為700bp，包含504bp的開放閱讀框，推測編碼的蛋白質為167aa，其5′和3′端的非編碼區(qū)分別為24bp和172bp。通過熒光定量PCR的方法研究了EsLecA和EsLecB基因在中華絨螯蟹的組織表達分布以及經脂多糖和PolyI:C刺激后在血淋巴、腸、鰓和肝胰腺組織中的表達變化，發(fā)現EsLecA和EsLecB基因主要在肝胰腺中表達。與對照組相比，腸、鰓和肝胰腺在脂多糖和PolyI:C免疫后E

5、sLecA表達量均表現上調；與對照組相比，血淋巴、腸、鰓和肝胰腺在脂多糖和PolyI:C免疫后EsLecB表達量均表現上調。
　　 3.鐵蛋白是普遍存在于生物體內，具有鐵離子解毒和儲存等功能的蛋白，在構建脂多糖刺激的中華絨螯蟹cDNA文庫的基礎上，獲得了中華絨螯蟹鐵蛋白基因EsFer的cDNA序列，其全長為1,118bp，包含480bp的開放閱讀框，推測編碼的蛋白質為159aa，其5′和3′端的非編碼區(qū)分別為178bp和461b