油茶丙酮酸激酶基因的全長cDNA及部分基因組序列克隆.pdf

1、油茶是我國南方重要的木本油料樹種,是世界四大木本油料樹種之一。在油茶種子生長過程中,丙酮酸激酶(PK)基因作為糖酵解的關(guān)鍵酶,它控制生成的丙酮酸是脂肪酸合成的重要碳源,在光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為脂肪酸的過程中起重要作用。因此研究油茶的 PK基因在揭示糖酵解對油脂合成的影響和油茶的分子育種具有重要意義。本論文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.油茶PK基因的全長cDNA克隆。在經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室已構(gòu)建的油茶cDNA文庫中,鑒定出

2、一條 PK基因片斷,長度為約900bp,并且含有一個 polyA尾巴。將此cDNA序列同其它物種的同類序列進行比對發(fā)現(xiàn)相似性較高,并且此序列缺失5’端部分氨基酸殘基及非編碼區(qū)的cDNA序列。根據(jù)已知的PK基因EST序列,用專業(yè)軟件 Primer Premier’5.0設(shè)計了油茶PK基因的特異引物 GSP1、GSP2和GSP3。以油茶‘湘林1號’品種種子為材料提取 RNA,采用5'RACE技術(shù),擴增出一條約1500bp的cDNA片斷。將該

3、片斷克隆到pMD18-T載體上,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中。經(jīng)過菌液PCR檢測、測序,得到該片斷的cDNA序列。通過Vector NTI9.0等生物信息學(xué)軟件的分析,將該序列與原來的EST序列進行拼接,獲得了一條長為2114bp的序列。根據(jù)拼接得到的序列,設(shè)計了兩對引物OEF1、OER1和OEF2、OER2,其中OEF1位于PK基因序列的5’端,OER2位于3’端,OER1與OEF2位于5'RACE片斷和 EST片斷的重迭區(qū),且相向

4、重迭13bp。采用交錯延伸PCR技術(shù),用OEF1、OER1擴增5'RACE片斷,OEF2、OER2擴增.EST片斷,分別得到T1和T2,且它們有13bp的重迭部分。根據(jù)堿基互補原則,利用它們的重迭部分拼接成一個新的片斷,之后加入OEF1和OER2來擴增拼接片斷,從而獲得了油茶PK基因的全長cDNA。
　　 2.部分基因組序列克隆。以油茶‘湘林1號’品種葉片提取的基因組DNA為材料,以交錯延伸引物OEF2和OER2為引物,獲得長2

5、308bp的油茶PK基因部分基因組序列,通過NCBI網(wǎng)上比對確定其為油茶PK基因部分基因組序列。將油茶PK基因部分基因組序列與全長cDNA比較,分析預(yù)測此序列含兩個外顯子長度分別為476bp和220bp,一個內(nèi)含子長度為1578bp。
　　 3.油茶PK基因的生物信息學(xué)分析。通過生物信息學(xué)軟件 Vector NTI9.0對測序結(jié)果進行分析:PK基因cDNA序列長2114bp,含有一個1737bp的 ORF,編碼579個氨基酸殘基

6、；此外還含有長108bp的5端非編碼區(qū),長269bp的3端非編碼區(qū)及一個長44bp的polyA尾巴。經(jīng)過在GenBank上的序列比對獲知此序列與其它物種的PK基因的相似性很高,由此確認此序列是油茶的PK基因的全長cDNA序列。根據(jù)PK基因的cDNA序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列,應(yīng)用一系列生物信息學(xué)軟件對理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)、三維模型等進行預(yù)測分析,結(jié)果顯示此蛋白的等電點 pI為5.105,分子量為63766.5Da,穩(wěn)定系數(shù)為52.95,屬于不穩(wěn)