新生仔豬源大腸桿菌主要毒力因子的分子流行病學(xué)及其免疫防制.pdf

1、新生仔豬腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病；盡管導(dǎo)致仔豬腹瀉的原因非常復(fù)雜，但大腸桿菌作為其主要病原已經(jīng)明確。該研究根據(jù)GeneBank發(fā)表的大腸桿菌腸毒素ST1、ST2、 LT1以及耶爾森氏菌強(qiáng)毒力島(high pathogenicity island，HPI)的基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，建立了檢測(cè)相應(yīng)毒力因子的PCR方法。通過(guò)對(duì)已知毒力型參考菌株的擴(kuò)增，證明了所建立的PCR方法能夠特異鑒定產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotox igenic

2、Escherichia coli，ETEC)和HPI+大腸桿菌。采集臨床151例仔豬腹瀉病例的肛拭子樣品，接種LB肉湯于37℃增菌培養(yǎng)4~6h后，用所建立的PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明有95例(62％)為HPI+大腸桿菌感染，14例(9.27％)為HPI+大腸桿菌感染與EIEC混合感染，24例(15.8％)為ETEC感染。此外，通過(guò)對(duì)健康新生仔豬54份樣品的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)28發(fā)(51.8％)樣品攜帶HPI+大腸桿菌，6例(11％)攜帶ETE

3、C(主要為ST2+)，未發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的其它毒力因子，這表明HPI+大腸桿菌很可能是條件性致病菌。 為了揭示仔豬源大腸桿菌的O抗原型和主要毒力因子的相關(guān)性以及篩選具有優(yōu)勢(shì)血清型和優(yōu)勢(shì)毒力因子的疫苗侯選株，經(jīng)快速檢測(cè)為毒力因子陽(yáng)性的糞便樣品進(jìn)行了廣泛的細(xì)菌分離。經(jīng)生化試驗(yàn)以及毒力因子的PCR鑒定，共分離鑒定到89株大腸桿菌。通過(guò)對(duì)這89株分離株的O血清型與致病性大腸桿菌類型進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，除20株未定型，69株大腸桿菌分屬6

4、種不同的血清型，最流行的血清型為0138，共39株(44％)，其次為06511株(12％)；其中ETEC的主要血清型為0138(13％)、065(2％)、021(2％)；HPI+大腸桿菌的主要血清型為0138(21％)、065(8％)、021(6％)、0141(3％)、09(2％)、0159(2％);ETEC且攜帶HPI+大腸桿菌的主要血清型為0138(9％)、065(2％)、09(2％)、0139(1％)、055(1％)；進(jìn)一步分析顯

5、示，HPI與ETEC高度相關(guān)，36株ETEC中，攜帶HPI+有14株(39％)；菌毛檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，K88、987P是主要的黏附因子。運(yùn)用黏附素單抗對(duì)黏附素陽(yáng)性菌株進(jìn)行檢測(cè)篩選，結(jié)果只有部分K88陽(yáng)性菌株體外表達(dá)菌毛。結(jié)合PCR檢測(cè)，血清型鑒定，體外黏附素表達(dá)檢測(cè)，菌株0138:HPIK88：LT1可作為用于預(yù)防仔豬腹瀉的疫苗候選株。 在致仔豬腹瀉大腸桿菌主要毒力因子分子流行病學(xué)和血清流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，篩選了用于預(yù)防仔豬腹瀉的多價(jià)

6、滅活疫苗，經(jīng)成品檢驗(yàn)合格后免疫懷孕母豬，同時(shí)以商品化的三價(jià)苗為對(duì)照，通過(guò)定期采集母豬分娩后的乳汁，分離乳清進(jìn)行乳清中K88、987P、FyuA特異性抗體效價(jià)的測(cè)定。結(jié)果表明，在母豬分娩后不同時(shí)段，各免疫組別乳清中K88菌毛抗體的抗體效價(jià)具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。各免疫組別乳清中987P菌毛抗體的抗體效價(jià)也具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。其中本研究的多價(jià)苗與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。而各免疫組別乳

7、清中FyuA抗體的抗體效價(jià)僅在分娩后第一天差異顯著(P<0.01或P<0.05)。從抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律來(lái)看，通過(guò)兩針免疫母豬，其初乳中抗體的效價(jià)在分娩后一天為最高，以后逐漸下降，其中K88菌毛抗體在分娩后一周幾乎檢測(cè)不到抗體效價(jià)，而987P菌毛的抗體效價(jià)可以維持產(chǎn)后14天，而FyuA抗體的效價(jià)在分娩后波動(dòng)不大。 利用抗大腸桿菌K88和987P多價(jià)乳清抗體對(duì)K88和987P菌毛與小腸上皮細(xì)胞的黏附特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明免疫組