豬克隆胚胎體外發(fā)育過程中的凋亡與DNA甲基化分析.pdf

1、動(dòng)物克隆技術(shù)應(yīng)用目前所遭遇的瓶頸主要體現(xiàn)在技術(shù)效率總體上偏低，早期胚胎死亡率高、妊娠率低，胎兒或克隆動(dòng)物畸形率高；克隆技術(shù)的進(jìn)一步突破有賴于對(duì)存在問題本質(zhì)的探討。豬體細(xì)胞核移植(SCNT)在加速品種改良、建立動(dòng)物疾病模型等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，在異種器官移植、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)方面等也有巨大的應(yīng)用潛力。雖然SCNT技術(shù)已在包括豬在內(nèi)的多種動(dòng)物上獲得克隆后代，但動(dòng)物克隆生產(chǎn)的總體效率仍然很低，而豬SCNT的效率尤為低下，嚴(yán)重制約了該技術(shù)的進(jìn)

2、一步發(fā)展與應(yīng)用。要完善豬體細(xì)胞克隆技術(shù)程序，有必要對(duì)克隆胚胎發(fā)育過程中所存在的問題進(jìn)行分析。迄今為止，人們對(duì)于克隆胚胎體外發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡規(guī)律，克隆重構(gòu)胚表觀遺傳重編程機(jī)制等仍知之甚少。本試驗(yàn)以豬體外成熟卵母細(xì)胞為材料，系統(tǒng)研究豬體細(xì)胞克隆胚胎體外生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)；在優(yōu)化豬克隆胚胎體外生產(chǎn)程序的基礎(chǔ)上，對(duì)克隆胚胎體外發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡及DNA甲基化水平的變化規(guī)律進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討，以期了解豬克隆胚胎在體外發(fā)育與凋亡、DNA甲基化水平變化等方

3、面的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步完善豬體細(xì)胞克隆技術(shù)體系，提高豬克隆胚胎體外生產(chǎn)效率提供參考依據(jù)。本研究共包括以下6個(gè)部分：
　　 試驗(yàn)一、豬受體卵母細(xì)胞的體外成熟與去核本試驗(yàn)以屠宰場(chǎng)采集的豬卵巢為研究對(duì)象，系統(tǒng)比較體外成熟培養(yǎng)液、成熟時(shí)間及卵巢生理狀態(tài)等對(duì)豬受體卵母細(xì)胞體外成熟與去核的影響，旨在優(yōu)化豬卵母細(xì)胞采集及其體外成熟培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步研究豬體細(xì)胞核移植提供優(yōu)質(zhì)的受體卵母細(xì)胞。用抽吸法采集2～5 mm卵泡的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(C

4、OC)，隨機(jī)分為3組，比較3種成熟培養(yǎng)液對(duì)豬受體卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明10％新生牛血清(NCS)TCM199與NCSU23(BSA free)組的第一極體(pbⅠ)排出率均顯著高于0.1％聚乙烯醇(PVA)TCM199組(79.7％和77.0％對(duì)60.2％，P<0.05)；將COC隨機(jī)分為3組，采用10％NCSTCM199作成熟培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)42 h、44 h和46 h，Hoechst33342熒光染色鑒定表明，隨著體外成熟

5、時(shí)間的延長(zhǎng)，pbⅠ與卵母細(xì)胞核位置的偏離率逐漸增加，而去核率則逐漸降低，pbⅠ的偏離率與去核率之間呈負(fù)相關(guān)，體外成熟培養(yǎng)44 h，既能獲得較高的pbⅠ排出率(80.3％)，又可保障理想的去核率(82.5％)。分別從卵泡期與黃體期卵巢上收集COC，比較卵巢生理狀態(tài)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響，結(jié)果顯示卵泡期卵巢與黃體期卵巢組間的pbⅠ排出率無顯著差異(80.7％對(duì)77.9％，P>0.05)，但在去核率上卵泡期卵巢組顯著高于黃體期卵巢組(82.

6、5％對(duì)72.5％，P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采集卵巢卵泡期COC，以10％NCS TCM199體外成熟培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞44 h，可獲得理想的卵母細(xì)胞成熟率和去核率。
　　 試驗(yàn)二、不同來源核供體細(xì)胞對(duì)豬克隆重構(gòu)胚發(fā)育的影響本實(shí)驗(yàn)通過分離培養(yǎng)4種不同來源的豬核供體細(xì)胞，即豬胎兒成纖維細(xì)胞(pFF)、卵丘細(xì)胞(pCC)、顆粒細(xì)胞(pGC)及耳成纖維細(xì)胞(pEF)，研究比較其生物學(xué)特性及對(duì)克隆胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明，采用組織塊法分

7、離培養(yǎng)pFF與pEF，所形成細(xì)胞單層的時(shí)間分別為6～7 d和9～10 d，采用懸浮細(xì)胞接種法培養(yǎng)的pCC與pGC形成單層的時(shí)間分別為5～6 d和3～4d；生長(zhǎng)曲線與核型分析表明，本實(shí)驗(yàn)所分離的4種豬體細(xì)胞在前5代，其體外生長(zhǎng)特性均能符合體細(xì)胞體外生長(zhǎng)的一般規(guī)律，染色體倍性正常，可作為核移植的供體細(xì)胞使用；選用第3代pFF、pCC、pGC及pEF細(xì)胞分別進(jìn)行核移植，比較不同類型細(xì)胞對(duì)豬體細(xì)胞核移植效率的影響，結(jié)果顯示，以豬pCC為核供體所

8、構(gòu)建的克隆胚囊胚發(fā)育率顯著高于其他3組(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)表明，所分離的4種核供體細(xì)胞在前5代具有正常的體外生長(zhǎng)特性，但以卵丘細(xì)胞為核供體更有利于克隆胚胎的發(fā)育。
　　 試驗(yàn)三、豬體細(xì)胞克隆胚胎的體外生產(chǎn)本試驗(yàn)以豬卵丘細(xì)胞為核供體構(gòu)建克隆重構(gòu)胚，研究電融合/電激活參數(shù)和體外培養(yǎng)體系對(duì)豬克隆胚胎體外發(fā)育的影響，旨在優(yōu)化體細(xì)胞核移植程序，提高豬克隆胚胎體外生產(chǎn)效率。將重構(gòu)胚隨機(jī)分組，分別施以不同電場(chǎng)強(qiáng)度(1.0～2.0 kV/c

9、m)、脈沖寬度(20～120μs)和脈沖次數(shù)(1～3 DC)，結(jié)果表明選用1.5 kV/cm、80μs和1 DC的參數(shù)組合，對(duì)豬核移植重構(gòu)胚進(jìn)行電融合和電激活，獲得最高的囊胚發(fā)育率。在體外培養(yǎng)72 h后，半量換液并未改善克隆胚的發(fā)育，但添加10％胎牛血清(FBS)可顯著提高克隆胚囊胚發(fā)育率(15.1％對(duì)10.3％，P<0.05)；采用豬卵泡顆粒細(xì)胞(pGC)共培養(yǎng)體系未能顯著提高克隆胚發(fā)育率(P>0.05)，但采用經(jīng)10μg/mL絲裂霉

10、素滅活的卵丘細(xì)胞(pCC)單層共培養(yǎng)可顯著提高克隆胚囊胚發(fā)育率(26.6％對(duì)13.O％，P<0.05)；與體外受精胚胎相比，克隆胚的卵裂率沒有顯著差異，但其囊胚發(fā)育能力仍然較低(24.6％對(duì)29.8％，P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)表明采用1.5 kV/cm、80μs和1 DC的參數(shù)組合進(jìn)行電融合/電激活后，與絲裂霉素滅活的pCC單層共培養(yǎng)，并在體外培養(yǎng)72 h后添加10％FBS可以顯著提高克隆胚的體外發(fā)育能力。
　　 試驗(yàn)四、豬克隆胚

11、胎的凋亡分析本試驗(yàn)旨在研究豬SCNT胚胎體外發(fā)育過程中的凋亡規(guī)律，探討細(xì)胞凋亡與克隆胚胎發(fā)育的關(guān)系。將體外成熟培養(yǎng)的MⅡ期卵母細(xì)胞隨機(jī)分為2組，分別進(jìn)行IVF與SCNT處理。以體外受精(in vitro fertilization，IVF)胚胎為對(duì)照，采用彗星試驗(yàn)(Comet assay)研究比較豬SCNT胚胎的體外發(fā)育與凋亡變化規(guī)律。結(jié)果表明，豬SCNT胚胎的卵裂率與IVF組無顯著差異，而囊胚發(fā)育率顯著低于IVF組；但與滅活的pCC單

12、層共培養(yǎng)，豬SCNT胚胎的囊胚發(fā)育率顯著升高(26.6％對(duì)13.0％P<0.05)。彗星試驗(yàn)表明SCNT與IVF胚胎的凋亡率均隨胚胎發(fā)育而呈不斷增加的趨勢(shì)，并在2-細(xì)胞期(8.3％對(duì)2.1％，P<0.05)與囊胚期(46.2％對(duì)26.1％，P<0.05)，SCNT組胚胎的凋亡率顯著高于IVF組；但與滅活的pCC單層共培養(yǎng)明顯降低了SCNT胚胎囊胚期細(xì)胞凋亡率(27.6％對(duì)46.2％，P<0.05)。本研究表明豬克隆胚胎生產(chǎn)效率低可能與細(xì)

13、胞凋亡有關(guān)，但與滅活的pCC單層共培養(yǎng)可明顯抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)克隆胚胎的發(fā)育(P<0.05)。彗星試驗(yàn)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏以及樣品需求量少等優(yōu)點(diǎn)，可以用于檢測(cè)豬早期胚胎細(xì)胞凋亡。
　　 試驗(yàn)五、豬克隆胚胎體外發(fā)育過程中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)本試驗(yàn)旨在研究豬SCNT胚胎體外發(fā)育與凋亡過程中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)模式，分析豬SCNT胚胎凋亡的分子調(diào)控機(jī)制。以豬體外受精(IVF)胚胎為對(duì)照，采用Real-time RT PCR技術(shù)對(duì)豬SCNT

14、胚胎不同發(fā)育階段的凋亡相關(guān)基因Fas/FasL及Bcl-2 mRNA水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果表明，在8-細(xì)胞期以前，豬IVF與SCNT胚胎的Fas、FasL mRNA一直維持低水平表達(dá)，8-細(xì)胞以后Fas、FasL mRNA水平均有所升高，且SCNT胚胎升高最為明顯，特別是在囊胚期，F(xiàn)as、FasL mRNA表達(dá)量均顯著高于IVF組(P<0.05)。隨著胚胎的不斷發(fā)育，IVF與SCNT胚胎的Bcl-2 mRNA表達(dá)量均逐漸下降，至囊胚

15、期SCNT胚胎Bcl-2 mRNA水平顯著低于IVF組(P<0.05)；與pCC共培養(yǎng)使克隆胚胎囊胚期的Fas/FasL mRNA表達(dá)明顯下降，并顯著提高Bcl-2 mRNA表達(dá)水平。本試驗(yàn)表明，豬克隆胚胎體外生產(chǎn)效率低下與胚胎的異常凋亡相關(guān)，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)參與了克隆囊胚階段的凋亡調(diào)控；與豬卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)可通過影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制豬SCNT胚胎的凋亡。
　　 試驗(yàn)六、豬克隆胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化相關(guān)基因的表

16、達(dá)為探討豬克隆胚胎體外發(fā)育過程中DNA甲基化相關(guān)基因表達(dá)的變化規(guī)律，采用Real-time RT PCR技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段的豬克隆胚胎DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCNT與IVF胚胎發(fā)育過程中Dnmt1 mRNA表達(dá)具有相似的降低趨勢(shì)，但I(xiàn)VF胚胎在8-細(xì)胞以前的表達(dá)量下降更為劇烈，且在4-至8-細(xì)胞期的表達(dá)量顯著低于SCNT胚胎組(P<0.05)。Dnmt3a mRNA在SCNT

17、與IVF胚胎2-至4-細(xì)胞階段均維持較低的表達(dá)水平，但從8-細(xì)胞期開始，Dnmt3a mRNA表達(dá)水平開始逐漸上升，且SCNT胚胎組增加程度更為劇烈，囊胚期的SXNT組Dnmt3a mRNA表達(dá)水平均顯著高于IVF組(P<0.05)。此外，pCC單層共培養(yǎng)時(shí)，克隆胚胎Dnmt1和Dnmt3a mRNA表達(dá)并未發(fā)生明顯的變化。本試驗(yàn)表明，豬克隆胚胎體外發(fā)育率低可能與特定發(fā)育時(shí)期DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)基因高表達(dá)所導(dǎo)致的供體核不完全重