三個(gè)棉花生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的克隆與鑒定.pdf

1、棉花種植廣泛，是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要物資，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有重要地位。由于生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理反應(yīng)的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，生長(zhǎng)素可以調(diào)控細(xì)胞的伸長(zhǎng)、分裂和分化，以及植物的頂端優(yōu)勢(shì)、不定根的形成、植物的向性反應(yīng)、果實(shí)的發(fā)育、和胚的形成等方面。因此，研究棉花生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程以及轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要元件具有重要意義，同時(shí)研究棉花生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因的生物學(xué)功能，對(duì)全面了解生長(zhǎng)素在棉花的生長(zhǎng)發(fā)育以及形態(tài)建成過(guò)程中所發(fā)揮的作用，以及闡

2、明棉花中生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜分子機(jī)制具有重要的理論意義。已有的研究成果表明，生長(zhǎng)素調(diào)控的過(guò)程更多是通過(guò)調(diào)控其它基因表達(dá)來(lái)影響植物的發(fā)育和其他的一些反應(yīng)，這些被調(diào)控的基因稱為生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的原初表達(dá)基因，能夠被生長(zhǎng)素誘導(dǎo)繼而快速、特異、并且在不需要新的蛋白質(zhì)生物合成的條件下表達(dá)。原初反應(yīng)基因包括Aux/IAAs( auxin/indoleacetis acids proteins)、SAURs(small auxin-up RNA)和GH3等

3、三類主要的轉(zhuǎn)錄因子家族。
　　 本研究利用cDNA芯片技術(shù)在棉纖維發(fā)育開(kāi)花后5天(5DPA)、10天(10DPA)、15天(15DPA)、20天(20DPA)、25天(25DPA)篩選陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和優(yōu)質(zhì)抗病品種海島棉7124的差異表達(dá)基因，克隆得到與棉花生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的3個(gè)重要cDNA克隆，并通過(guò)Real-Time PCR( Q-PCR)驗(yàn)證了基因表達(dá)：
　　 (1)生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白ABP(auxin-bi

4、nding protein, GhABP)（GenB ank登錄號(hào)：AAO92740）該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度為897bp，開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為618bp，編碼206個(gè)氨基酸；(2)兩個(gè)生長(zhǎng)素原初反應(yīng)基因(primary auxin responsive genes)，一個(gè)屬于其中的生長(zhǎng)素/吲哚乙酸蛋白( auxin/indoleacetis acids proteins, Aux/IAAs)超家族成員，該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度為101

5、4bp，開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為726bp，編碼242個(gè)氨基酸，Blastx比對(duì)與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、蓖麻(Ricinus communis)、番薯（Ipomoeanil）等物種的IAA16都有一定相似度，因此將其命名為GhIAA16a;另一個(gè)屬于生長(zhǎng)素原初反應(yīng)基因其中的SAURs( small auxin-up RNAs)轉(zhuǎn)錄因子家族，該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度為794bp，開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為366bp，編碼12

6、2個(gè)氨基酸，Blastx比對(duì)與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米（Zea mays）等物種的SAUR基因具有一定的相似性，因此將該基因命名為GhSAUR2。
　　 采用SignalP程序?qū)@三個(gè)基因進(jìn)行了N端信號(hào)肽預(yù)測(cè)，GhSAUR2、GhIAA16a均無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，只有GhABP具有典型的信號(hào)肽，說(shuō)明只有GhABP為分泌蛋白。并且對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行了保守區(qū)域分析等。
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

7、(Real-time quantitative PCR)驗(yàn)證各基因的表達(dá)，結(jié)果與芯片基本一致。其中GhABP與GhIAA16a表達(dá)趨勢(shì)相反，在棉纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)期（開(kāi)花后10天）GhABP高量表達(dá)，而GhIAA16a表達(dá)量達(dá)最低，10天以后到25天GhABP表達(dá)量逐漸下降而GhIAA16a逐漸上升。說(shuō)明GhABP基因可能是促進(jìn)棉纖維發(fā)育，而GhIAA16a則和抑制棉纖維發(fā)育有關(guān)。
　　 利用本實(shí)驗(yàn)室陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和海島棉7

8、124培育的140個(gè)BC1作圖群體分別對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行染色體定位，GhABP、GhIAA16a定位到11號(hào)染色體，GhSAUR2定位到第8號(hào)染色體。
　　 對(duì)GhABP、GhIAA16a、與GhSAUR2基因分別構(gòu)建了GFP載體，然后利用基因槍法轟擊洋蔥表皮，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GhABP定位于細(xì)胞膜上，GhIAA16a基因定位于細(xì)胞核上。
　　 對(duì)GhABP、GhIAA16a與GhSAUR2基因分別構(gòu)建了pBI121-3