紅壤宏基因組BAC文庫構建及β-1,4-葡聚糖內切酶新基因的克隆和表達.pdf

1、紅壤是我國南方典型的土壤資源類型,因其所處的特殊地理環(huán)境和氣候特征,紅壤具有pH值較低、水熱條件充足和生物多樣性程度高等特點,其中可能蘊含著新的、有應用價值的基因資源.土壤樣品的宏基因組學(metagenomics)是對土壤樣品中微生物群體基因組進行的一種分析,這種方法可以超越培養(yǎng)手段而直接從土壤中獲得新的基因資源,因此在眾多用于獲得未培養(yǎng)微生物的生理和遺傳特性的方法中,逐漸顯示出強大的優(yōu)勢。通過構建紅壤的宏基因組文庫,對紅壤微生物群落

2、結構進行研究,能揭示出紅壤微生物群落結構與紅壤理化性質之間的內在聯(lián)系,從而為改善紅壤當前的生態(tài)環(huán)境提供理論依據(jù),并獲得新的、有價值的基因資源。
　　 本文以兩種不同的土壤類型江西紅壤和南京沙質粘土為研究材料,通過對土壤微生物菌體回收的各影響因素的比較分析,確定了土壤中微生物菌體的提取純化方法；并利用從紅壤中分離提取的菌體細胞為材料,將其包埋裂解獲得了大片段總DNA,以BAC為載體構建了大片段宏基因組文庫；對文庫進行基于功能的篩選

3、,獲得一β-1,4葡聚糖內切酶基因,并實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的過量表達,且對其酶學性質進行了分析研究,確定其為纖維素水解酶家族的新成員。
　　 通過對土壤中微生物菌體回收的各影響因素諸如分散方式、離心力、分散劑、混合酶液消化處理、蔗糖和Nycodenz密度梯度離心的比較分析,確定了從土壤中提取純化微生物菌體的方法。以焦磷酸鈉作為分散劑勻漿作為分散方式分散土壤顆粒后,用蔗糖密度梯度離心代替?zhèn)鹘y(tǒng)的差速離心來提取微生物菌體,經(jīng)過一次

4、離心可以獲得70％以上的菌體細胞。再用0.8％氯化鈉溶液重懸菌體進行Nycodenz密度梯度離心,獲得了純化的菌體細胞。與傳統(tǒng)的以0.8％氯化鈉作為分散劑分散土壤后直接進行Nycodenz離心提取菌體的方法相比,該提取流程不但有效地去除了菌體提取物中的雜質,還將菌體提取率從不到l0％提高到了30％以上。利用核糖體DNA間區(qū)分析(RISA)技術分析所提取細菌菌體的群落結構,發(fā)現(xiàn)其與原始土壤里的細菌群落結構組成類似,說明該菌體提取純化流程對

5、土壤微生物群落結構組成沒有造成較大的改變。
　　 將從紅壤中提取的菌體細胞反復洗滌后,用低熔點瓊脂糖將菌體包埋起來進行裂解,獲得了大小超過400 kb的大片段總DNA。利用限制性內切酶Sau3AI部分酶切總DNA后,經(jīng)脈沖場凝膠電泳分離和電洗脫收集50～100 kb的DNA片段,與用質粒pCUGIBACI經(jīng)限制性內切酶BamHI處理并經(jīng)去磷酸化制備的pIndigoBac536載體連接后導入E.coli DH10B中,構建了土壤宏

6、基因組BAC文庫。該文庫含3,024個陽性克隆子,外源插入片段大小在25～165 kb之間,70％的克隆子所含外源插入片段在50～100 kb之間,平均插入片段大小約為75 kb。該文庫庫容約為200 Mb,絕大部分克隆子中所攜帶的外源DNA片段中富含GC。隨機挑選10個克隆子進行BAC末端測序的結果表明,9個克隆子中所包含的外源片段目前為止不存在于現(xiàn)有的基因組數(shù)據(jù)庫中,應為新序列,其對應的氨基酸序列與已知的功能蛋白的同源性也很低。

7、r>　　 對文庫進行基于活性的篩選,發(fā)現(xiàn)一克隆子RSB-1227能夠在羧甲基纖維素鈉-剛果紅平板上產(chǎn)生較大水解圈。將該克隆子中的質粒pRSB-1227提取出來,經(jīng)限制性內切酶NotⅠ酶切驗證無誤并確定外源片段大小在60 kb左右后。重新將該質粒用電轉化導入E.coli DH10B中,所得陽性克隆子皆具備該水解活性,確定了該纖維素水解酶基因確實由質粒pRSB-1227攜帶。對克隆子RSB-1227進行亞克隆并測序的結果顯示,其中含有能夠

8、編碼β-1,4葡聚糖內切酶(纖維素降解過程中的關鍵酶之一)的基因。該基因序列與已發(fā)現(xiàn)同類基因沒有同源性,其編碼的氨基酸序列同源性亦低于40％,屬于糖苷水解酶第五家族,將該基因命名為cel5G。
　　 將基因cel5G擴增出來,與載體pET29a(+)連接后構建表達載體pET29a-cel5G,并導入宿主菌E.coli BL21中,構建表達菌株。用IPTG誘導表達該基因,獲得了大量的重組酶Cel5G,經(jīng)SDS-PAGE驗證其分子量

9、約為50kDa,與用氨基酸序列預測的分子量49.8 kDa一致。經(jīng)熱處理、硫酸銨沉淀及分子篩純化該蛋白后,用于其酶學性質及水解特性研究。Cel5G最適反應pH值為4.8,最適反應溫度為50℃,其pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性良好,在高鹽條件下穩(wěn)定且可以顯示較高的酶活力,并對蛋白酶有較強的耐受性。該酶可以水解多種以β-1,4-,β-1,3/β-1,4-或β-1,3/β-1,6-糖苷鍵連接的多聚物,也可以水解無定形纖維素、濾紙和微晶纖維素,以CMC-