柞蠶桿狀病毒激活禽類非特異性免疫的研究.pdf

1、禽類是重要的經(jīng)濟(jì)動物，而禽疫病一直制約著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。盡管目前有很多禽類疫苗可以供為選擇，但它們大多是針對特異性免疫，起效慢，作用專一，禽類有時在疫苗提供有效保護(hù)前就已經(jīng)發(fā)生了病毒感染。非特異性免疫是抵抗微生物感染的第一道防線，具有起效快，作用范圍廣的特點。因此，目前很多研究者都在尋找和鑒定能有效激活禽類非特異性免疫的新型免疫調(diào)節(jié)劑。
　　 本論文通過Real-time PCR、siRNA干擾、Western blot以及藥物阻

2、斷信號通路等方法分析了柞蠶桿狀病毒在提高雞非特異性免疫上所起的重要作用，闡明了柞蠶桿狀病毒侵入靶細(xì)胞的機(jī)制，并重點研究了柞蠶桿狀病毒增強(qiáng)雞非特異性免疫功能發(fā)生的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.體外以柞蠶出芽型桿狀病毒粒子(BV)刺激雞各免疫細(xì)胞，分別采用Real-timePCR檢測雞外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和雞巨噬細(xì)胞系(HD11)的各細(xì)胞因子的表達(dá)，Griess試劑法檢測HD11細(xì)胞一氧化氮(NO)的

3、產(chǎn)生量，β-葡萄糖苷酸酶釋放法檢測異嗜白細(xì)胞脫粒效應(yīng)。體內(nèi)以BV滴鼻免疫的雛雞，24 h后再以致死劑量的雞支氣管炎病毒(IBV)進(jìn)行攻毒，跟蹤14d，記錄雛雞成活率。結(jié)果顯示：BV能顯著提高PBMC和HD11細(xì)胞的IL-6、IL-12、IFN-Y等細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平，誘導(dǎo)HD11細(xì)胞產(chǎn)生大量NO，并刺激異嗜白細(xì)胞發(fā)生脫顆粒反應(yīng)。25μg劑量的BV可以明顯提高雛雞的成活率達(dá)80％。以上結(jié)果表明BV在體內(nèi)和體外都能有效激活雞的非特異

4、性免疫。
　　 2.采用Real-time PCR檢測了經(jīng)不同方式滅活的BV、脂質(zhì)體包埋的BV DNA以及裸BV DNA誘導(dǎo)HD11細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的能力，并分析了細(xì)胞內(nèi)吞和內(nèi)體成熟抑制劑對BV誘導(dǎo)HD11細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響。結(jié)果顯示：經(jīng)不同方式滅活的BV其誘導(dǎo)HD11細(xì)胞活化的能力喪失；經(jīng)脂質(zhì)體包埋的BV DNA能夠誘導(dǎo)HD11細(xì)胞活化，而裸BV DNA不能誘導(dǎo)HD11細(xì)胞活化：細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑MDC和內(nèi)體成熟抑制劑氯喹均能

5、抑制BV誘導(dǎo)的HD11活化。以上結(jié)果表明BV憑借囊膜上的蛋白識別靶細(xì)胞，依賴于靶細(xì)胞的內(nèi)體成熟以內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞后由病毒DNA起免疫激活作用。
　　 3.采用RT-PCR和Real time PCR對BV作用前后的雞HD11細(xì)胞Toll樣受體( ChTLRl-5，7，21)的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，BV作用前，所有檢測的ChTLR都有表達(dá)；BV作用后，只有ChTLR21的mRNA表達(dá)顯著提高，其它ChTLR m

6、RNA表達(dá)量不變或下降。進(jìn)一步采用siRNA干擾技術(shù)將ChTLR21基因沉默，檢測其對BV誘導(dǎo)的HD11細(xì)胞活化的影響。結(jié)果顯示：ChTLR21 siRNA干擾后的HD11細(xì)胞其細(xì)胞柞蠶桿狀病毒激活禽類非特異性免疫的研究因子(IFN-y和IL-12)的表達(dá)及NO的產(chǎn)生都明顯下降。以上結(jié)果表明BV誘導(dǎo)HDlI細(xì)胞的活化要依賴于ChTLR21途徑。
　　 4.利用Western blot方法檢測了BV作用后HDI1細(xì)胞的MAPK和N

7、F-1B蛋白的活化情況，并進(jìn)一步利用各通路的特異性抑制劑分析了BV誘導(dǎo)HDI1細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子(IFN-y和IL-12)及產(chǎn)生NO的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果顯示BV能夠使MAPK信號通路中的ERK、P38和JNK蛋白發(fā)生磷酸化，并能激活NF-1cB使其進(jìn)入核內(nèi)。P38和NF-1B的特異性抑制劑能夠抑制BV誘導(dǎo)的HD11細(xì)胞的細(xì)胞因子(IL-12和IFN-y)的表達(dá)及NO的產(chǎn)生；JNK的特異性抑制劑僅抑制細(xì)胞因子的表達(dá)；ERK的抑制劑則對細(xì)胞因