大腸桿菌K88噬菌體的分離、分類初步鑒定和生物學(xué)特性的測(cè)定.pdf

1、由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的幼畜腹瀉，在國(guó)內(nèi)甚至在全球范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)都造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在其病原菌中E.coli K88的流行性相對(duì)最廣，并以E.coli K88ac為優(yōu)勢(shì)血清型。目前，還沒有一種長(zhǎng)期有效的方法能夠控制此病。E.coli K88耐藥性菌株正逐年增加，所以對(duì)于該病的控制不能過分的依賴于抗生素。現(xiàn)在，越來(lái)越多的研究者支持利用裂解性噬菌體來(lái)預(yù)防和治療

2、E.coli K88大腸桿菌病。 本試驗(yàn)以E.coli K88為宿主菌，采用雙層瓊脂平板法從100份污水和糞便樣品中分離到3株裂解E.coli K88的噬菌體，分別命名為BpB、BpC、BpD，其中BpB分離自揚(yáng)州大學(xué)附近的河水，BpC和BpD分離自豬場(chǎng)污水和糞便。3株噬菌體增殖后的效價(jià)較高，均達(dá)到109pfu/ml以上。對(duì)3株噬菌體進(jìn)行裂解譜的測(cè)定，噬菌體BpB、BpC和BpD對(duì)16株E.coli K88裂解比例分別為9/16

3、、11/16和14/16。除E.coli K88外，噬菌體BpD還可以裂解E.coli987P(5株)和E.coli F18(4株)的某些菌株，裂解比例分別為2/5和2/4。通過3株噬菌體分別對(duì)E.coli K88ab、E.coli K88ac和E.coli K88ad的裂解曲線可以看到，噬菌體BpB、BpC對(duì)E.coliK88ad沒有裂解作用，其噬菌體與細(xì)菌混合液的OD600值會(huì)一直呈上升趨勢(shì)：BpB和BpC對(duì)E.coli K88ab

4、和E.coli K88ac均有裂解作用，則混合液的OD600值會(huì)先升高然后下降，下降到一定程度后有再升高的趨勢(shì)。噬菌體BpD可強(qiáng)裂解E.coliK88ac和E.coli K88ad，其OD600值一直保持在較低水平(<1.0)，在測(cè)試時(shí)間內(nèi)沒有再升高的趨勢(shì)，BpD弱裂解E.coli K88ab，其裂解曲線只有一個(gè)小幅度的上升和下降，之后就大幅度上升，在測(cè)試時(shí)間的末期，其OD600值接近于對(duì)照組(對(duì)照組為沒有噬菌體BpD的E.coli K

5、88ab菌液)。 在3株噬菌體中，噬菌體BpB、BpD噬菌斑較大，邊緣整齊而且透明，對(duì)其進(jìn)行大量增殖培養(yǎng)，噬菌體顆粒經(jīng)1mol/L NaCl-10％PEG沉淀和20％蔗糖摯底離心純化、磷鎢酸染色后進(jìn)行透射電鏡觀察，電鏡下可以看到：噬菌體BpB由頭部和尾部組成，頭部為等軸對(duì)稱，直徑56～60nm，呈六邊形，尾長(zhǎng)16nm左右。從形態(tài)上，噬菌體BpB屬于C1形態(tài)群。噬菌體BpD有一長(zhǎng)多面體對(duì)稱的頭部，直徑約81×109nm，頭長(zhǎng)徑與橫

6、徑的比L/W=1.3，呈六邊形：有一長(zhǎng)約112nm、寬12nm的尾，有肌鞘并且可發(fā)生收縮。從形態(tài)上，噬菌體BpD屬于A2形態(tài)群，與T4噬菌體非常相似。根據(jù)ICTV病毒分類第八次報(bào)告，噬菌體BpB屬于有尾噬菌體目，短尾噬菌體科，噬菌體BpD屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科，T4-Iike噬菌體屬。 根據(jù)T4-type噬菌體的尾鞘基因gene18和主要衣殼基因gene23的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到BpD gene18

7、和gene23保守區(qū)基因，通過序列分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體BpD擴(kuò)增得到的gene18和gene23片段分別為1330bp和845bp，推導(dǎo)的氨基酸序列分別為gp18(443 aa)和gp23(281 aa)，與T4噬菌體相應(yīng)部分的氨基酸同源性分別為67％和84％，與噬菌體JS98的同源性最高，均為96％，JS98屬于pseudo T-evens亞群。應(yīng)用DNAStar和TreeV32生物軟件，分別構(gòu)建基于gp18和gp23氨基酸序列的T4-t

8、ype噬菌體的系統(tǒng)進(jìn)化樹，噬菌體BpD與噬菌體JS98遺傳距離最近，位于T4-type噬菌體pseudo T-evens亞群。 為了了解噬菌體BpD的生物學(xué)特性，測(cè)定其熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、最佳感染復(fù)數(shù)和一步生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明：噬菌體BpD在60℃作用30min，效價(jià)高于106pfu/mL，在pH5～9范圍內(nèi)作用16h，效價(jià)高于108 pfu/mL，所以BpD的熱穩(wěn)定性和pH耐受性均較強(qiáng)。BpD裂解E.coli K88ac的最佳