西瓜枯萎病拮抗菌株篩選及其活性物質(zhì)的研究.pdf

1、西瓜枯萎病是世界各主要西瓜產(chǎn)區(qū)最為嚴(yán)重的病害之一。本課題以西瓜枯萎病的病原菌為篩選模型，采用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選西瓜枯萎病拮抗菌株，并研究拮抗菌株所產(chǎn)生的活性物質(zhì)。首先采集合肥、馬鞍山等地健康西瓜的根際土壤，進(jìn)行菌株的分離純化，建立了細(xì)菌菌種庫(kù)；再用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選出西瓜枯萎病拮抗菌株，獲得拮抗作用很強(qiáng)的菌株FM4；然后對(duì)FM4進(jìn)行了詳細(xì)的研究：包括菌株鑒定、活性物質(zhì)的分離純化及其理化性質(zhì)研究、發(fā)酵條件優(yōu)化，并初步嘗試?yán)肗+注入法對(duì)FM4進(jìn)行

2、誘變育種。主要結(jié)論如下：
　　 1.采集安慶、合肥和馬鞍山地區(qū)健康西瓜的根際土壤，進(jìn)行菌株分離純化，獲得了784株不同類型的菌株，對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果表明，對(duì)西瓜枯萎病有拮抗作用的有29株。其中，菌株FM4拮抗作用很強(qiáng)。
　　 2.根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的有關(guān)細(xì)菌分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)M4菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化性質(zhì)與微球菌屬的主要鑒別特征基本一致。由此，初步認(rèn)定FM4菌株屬于為微球菌屬。

3、　　 3.采用醇沉和Sephadex G-150凝膠層析法對(duì)拮抗菌株FM4的活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，從中分離得到一個(gè)拮抗蛋白質(zhì)，分子量約120kDa。經(jīng)質(zhì)譜初步鑒定，可知該蛋白與來(lái)源于Brevibacillus brevis的Middle cell wall proteinprecursor(MWP)有較高的相似度。實(shí)驗(yàn)表明，該抗菌物質(zhì)具有拮抗活性穩(wěn)定、耐熱性好、pH值穩(wěn)定及抗菌譜廣的特性，在25-100℃范圍內(nèi)隨著處理溫度的提高，抑菌

4、能力呈穩(wěn)定趨勢(shì)，幾乎不變化。對(duì)不同酸堿度的試驗(yàn)表明抗菌物的活性pH范圍較寬，從pH2-10，檢測(cè)皆有活性。活性物質(zhì)對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、畢氏酵母菌、腸膜明串珠菌、里氏木霉菌皆具有抑制作用。在西瓜枯萎病的防治中有著廣闊的應(yīng)用前景。
　　 4.本研究采用單因素加正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法和響應(yīng)曲面法，對(duì)拮抗菌株FM4分別進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。獲得了最佳的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件：葡萄糖1.00％，蛋白胨2.23％，磷酸氫二鉀0

5、.01％，七水硫酸鎂0.05％。最佳的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間22h，培養(yǎng)溫度28.5℃，初始pH為7.50，搖床轉(zhuǎn)速170.00r/min。與原始發(fā)酵條件相比，發(fā)酵液抑菌圈直徑提高了42.85％。
　　 5.采用N+注入法進(jìn)行高產(chǎn)菌株的初步選育。現(xiàn)代育種理論認(rèn)為誘變微生物致死率在70％～85％左右時(shí)正突變率較高，實(shí)驗(yàn)表明，選擇10 keV，40×2.6×1013N+/cm2作為該菌株的離子注入?yún)?shù)，致死率在81.25％左右。第一輪