一種新型減毒沙門氏菌疫苗載體的構(gòu)建.pdf

1、中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文一種新型減毒沙門氏菌疫苗載體的構(gòu)建姓名：姜娜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：劉純杰20090521一種新型減毒沙門氏菌疫苗載體的構(gòu)建變化較野生株的都明顯減輕，但未觀察到小鼠死亡，因而無法計(jì)算和比較半數(shù)致死量(LDso)。另一方面，為了更好地在小鼠模型中評(píng)價(jià)減毒株的安全性，我們同時(shí)用鼠傷寒沙門氏菌11174平行地做了rfaH和ssaV基因敲除工作。用鼠傷寒沙門氏菌11174及其ArfaHAs

2、saV雙敲除株分口服和腹腔注射兩種途徑感染小鼠，結(jié)果顯示：在口服感染中，11174雙敲株較對(duì)照株11174的LD50至少升高了105倍；而在腹腔注射感染中，雙敲株的LD50較對(duì)照株11174至少升高了103。從體外和體內(nèi)水平都已證明雙敲除株ArfaHAssaV減毒效果十分顯著。最后，應(yīng)用基因重組的方法，將編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的報(bào)告基因egfp敲入已構(gòu)建的減毒菌株Sty2ArfaHAssaV染色體，與外膜蛋白A(OmpA)的

3、C一端融合表達(dá)于載體菌株表面，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光，說明報(bào)告基因表達(dá)。采用同樣的方法并在減毒株染色體上選擇相同靶標(biāo)，將幽門螺桿菌保護(hù)性抗原尿素酶B(UreB)基因片段敲入sty2ArfaHAssaV的相同位置，得到重組菌Sty2ArfaHAssaVureB，通過用UreB單抗A3C10進(jìn)行免疫印跡分析以及間接免疫熒光，都證實(shí)目標(biāo)蛋白呈現(xiàn)表達(dá)于菌體表面。為了對(duì)上述新型沙門氏菌載體表達(dá)系統(tǒng)的有效性進(jìn)行檢驗(yàn)評(píng)價(jià)，分別采用經(jīng)鼻飼途

4、徑和口胃途徑將表達(dá)系統(tǒng)Sty2ArfaHAssaVureB免疫小鼠。在鼻飼免疫后，無論高劑量組還是低劑量組都有效地激發(fā)了機(jī)體針對(duì)外源抗原UreB的免疫反應(yīng)，抗外源抗原的IgG滴度為1：3200，抗載體菌的IgG滴度為1：32001：6400。而口服免疫后，高、低劑量組也都有效地激發(fā)了機(jī)體針對(duì)外源抗原UreB的免疫反應(yīng)，抗外源抗原ureB的IgG滴度為1：3200—1：6400，而抗載體菌的IgO滴度為1：6400—1：12800，且每只

5、小鼠的抗載體菌與抗外源抗原UreB的IgG滴度大小具有對(duì)應(yīng)關(guān)系。腸洗液sIgA的滴度與陰性對(duì)照差別顯著，表明口服免疫的兩組都產(chǎn)生了UreB特異性抗體IgA，引起了黏膜免疫應(yīng)答。綜合以上免疫學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果，此表達(dá)系統(tǒng)不僅能同時(shí)激發(fā)外源抗原特異性和疫苗載體特異性的有效體液免疫應(yīng)答，而且能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的黏膜免疫反應(yīng)。本研究的結(jié)果證實(shí)了應(yīng)用％Red重組系統(tǒng)敲除傷寒沙門氏菌染色體上毒力相關(guān)基因，并以此構(gòu)建活菌疫苗載體的方法是可行的。以敲除rfaH