多胺對小菜蛾嗅覺影響機制的研究.pdf

1、昆蟲的嗅覺在昆蟲尋找配偶和食物、搜尋產(chǎn)卵場所、躲避外界不利環(huán)境的傷害等起著非常重要的作用。多胺是生物體內(nèi)普遍存在的具有生物活性的一類低分子量含氮堿類，是精氨酸（Arg）代謝過程中產(chǎn)生的一類低分子胺，主要有腐胺、亞精胺和精胺。研究表明多胺能夠參與昆蟲行為的調(diào)節(jié)過程。本課題以小菜蛾Plutella xylostella為研究對象，對其嗅覺相關蛋白以及多胺對小菜蛾嗅覺相關蛋白基因表達的影響進行了研究，主要結果如下：
　　 1、小菜蛾嗅

2、覺相關蛋白基因的克隆和序列分析
　　 利用RT-PCR和RACE技術克隆到小菜蛾2個普通氣味結合蛋白（GOBP）基因PxylGOBP1（GenBank登錄號：ABY71034）和PxylGOBP2（GenBank登錄號：ABY71035），其核苷酸序列全長分別為504 bp和483 bp，編碼168和163個氨基酸殘基，這兩個基因編碼氨基酸序列和其它鱗翅目昆蟲GOBP的氨基酸序列比對同源性較高（70％～80％），但是PxylGO

3、BP1和PxylGOBP2的同源性只有50％，說明它們屬于不同的GOBP類群；1個信息素結合蛋白（PBP）基因PxylPBP1（GenBank登錄號：FJ201994），其核苷酸序列全長為504bp，編碼164個氨基酸殘基，這個基因編碼氨基酸序列和其它鱗翅目昆蟲PBPs比對同源性較高（70％～80％）；1個化學感受蛋白（CSP）基因PxlyCSP1（GenBank登錄號：FJ361903），其核苷酸序列全長405 bp，編碼134個氨基

4、酸殘基，該基因編碼氨基酸序列和其它鱗翅目昆蟲CSP的氨基酸序列比對同源性較高（70％～80％）。
　　 2、小菜蛾嗅覺相關基因的組織和時空表達
　　 RT-PCR結果表明，小菜蛾PxylGOBP1、PxylGOBP2和PxylPBP1在雌雄觸角中均有表達，在其他組織中（去觸角頭、足、腹部和翅）均沒有表達，而小菜蛾PxylCSP1不僅在雌雄觸角中表達，在其他組織（去觸角頭、足、腹部和翅）中也有表達。Real-timePCR

5、研究表明PxylGOBP1、PxylGOBP2、PxylPBP1和PxylCSP1的表達水平因被測小菜蛾的雌雄、日齡、組織不同和交配與否而異，這些基因在卵、幼蟲不同齡期和蛹期的表達量僅為0.01％左右；在卵、幼蟲和蛹期，PxylGOBP1的表達量均比PxylGOBP2高出3倍左右，而在成蟲期PxylGOBP1的表達量僅是PxylGOBP2的1/5，PxylGOBPs在1齡幼蟲時的表達量在整個幼蟲期最高，可能是和其一孵化出來就尋找寄主有關

6、；PxylPBP1的表達量在小菜蛾卵和蛹期相對幼蟲期較高，隨著齡期的增長表達量降低，到3齡幼蟲達到最低值后表達量呈上升趨勢，在成蟲期各時段雄蛾觸角中PxylPBP1的表達量均比雌蛾高，是雌蛾的3-30倍，在雌雄蛾交配后，PxylPBP1的表達量均比交配前高；PxylCSP1的表達量在小菜蛾卵期和蛹期表達量較幼蟲期明顯低，其僅為其的1/10左右，4齡幼蟲表達量在整個幼蟲期表達量最高，這些可能和小菜蛾幼蟲取食有關，成蟲期在羽化4-8h小菜蛾

7、PxylCSP1表達量較高，交配后雄蟲PxylCSP1的表達量明顯比交配前（羽化16 h）低，而雌蟲卻明顯比交配前（羽化16 h）高。綜上所述，小菜蛾嗅覺相關基因的表達和小菜蛾的雌雄、發(fā)育狀態(tài)和交配與否密切相關，這些是否和小菜蛾可塑性行為相關還有待我們進一步研究。
　　 3、多胺對小菜蛾嗅覺相關基因表達的影響
　　 腐胺處理后增高了未交配小菜蛾PxylGOBP1的表達，但卻明顯抑制了交配小菜蛾PxylGOBP1的表達；腐

8、胺處理后明顯抑制了小菜蛾PxylGOBP2的表達，僅對羽化初期（0、4h）的雌蛾觸角中PxylGOBP2的表達具有增強作用；明顯增強了交配雄蛾PxylPBP1的表達，但卻明顯減弱了交配雌蛾PxylPBP1的表達；經(jīng)腐胺處理后，雌雄小菜蛾不同時段PxylCSP1的表達量明顯降低，只有羽化16h時表達量升高。
　　 亞精胺處理后明顯抑制了小菜蛾PxylGOBP1的表達，但在羽化4h時雌雄蛾和交配后雌蛾PxylGOBP1的表達量和對照

9、丙酮處理比明顯增高；亞精胺處理后明顯抑制了小菜蛾PxylGOBP2的表達，但卻促進了羽化初期（0、4h）小菜蛾雌蛾PxylGOBP2的表達；經(jīng)亞精胺處理后小菜蛾雌雄蛾羽化不同時間觸角中PxylPBP1的表達均明顯受到抑制；亞精胺處理后明顯抑制了小菜蛾PxylCSP1的表達，但在羽化4h時雄蛾和交配后雌蛾PxylCSP1的表達量和對照丙酮處理比明顯增高。
　　 經(jīng)精胺和DFMO處理后，小菜蛾PxylGOBP1、PxylGOBP2和

10、PxylCSP1表達被明顯抑制在一個很低的水平（和對照丙酮處理相比）；經(jīng)精胺處理后，對小菜蛾雄蛾觸角中PxylPBP1的表達具有促進作用，但抑制了交配后雌雄蛾觸角中PxylPBP1的表達；經(jīng)DFMO處理后對雌雄蛾不同時期觸角中PxylPBP1的表達均具有抑制作用，但對羽化4h和16h雌蛾觸角中PxylPBP1的表達具有增強作用。
　　 綜上所述，多胺能調(diào)節(jié)小菜蛾觸角中嗅覺相關基因的表達，這種調(diào)節(jié)能力因處理、雌雄、羽化時間和交配與

11、否有關。
　　 4、小菜蛾嗅覺相關蛋白基因的原核表達及蛋白純化
　　 在成功克隆小菜蛾PxylGOBP1、PxylGOBP2、PxylPBP1和PxylCSP1基因的基礎上，利用基因重組的方法將這4個基因構建到原核表達載體pET-22b（+）中，在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，所表達的4個重組蛋白大小約為19kD、22kD、18kD和14kD左右，主要以包涵體形式存在。超聲波破碎離

12、心后，用8mol/L尿素對包涵體進行溶解，經(jīng)DE52陰離子親和層析柱一步法純化得到高純度重組蛋白，并且回收率也很高。
　　 5、小菜蛾嗅覺感器的掃描電鏡觀察
　　 利用掃描電鏡對小菜蛾觸角及其感器進行觀察和研究。結果表明，小菜蛾觸角為絲狀，其上共有12種感器：毛形感器、刺形感器、腔錐形感器、鱗形感器、栓錐形感器、具彎端感器、巨形感器、錐形感器、端毛、鐘形感器、棒形感器、叉形感器。對各種感器的形態(tài)、分布特點進行了描述，根據(jù)