豬圓環(huán)病毒2型分離鑒定、實(shí)時(shí)定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）為無(wú)囊膜的單股負(fù)鏈DNA病毒，屬圓環(huán)病毒科（Circoviridae）成員。其基因組為單股環(huán)狀DNA，病毒粒子無(wú)囊膜，呈二十面體對(duì)稱，是目前已知的最小病毒之一。PCV有1型（PCV1）和2型（PCV2）兩種基因型，PCV1首先由Tiseher于PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，基因組全長(zhǎng)1759bp，無(wú)致病變性；PCV2基因組長(zhǎng)1767bp或1768bp，被認(rèn)為是仔豬斷奶后多系

2、統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS）的主要病原。PMWS是一種以進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理?yè)p傷為主要特征的免疫抑制性疾病，主要發(fā)生在6-16周齡的斷奶仔豬。該病在我國(guó)自2000年首次報(bào)道以來(lái)，已廣泛流行于全國(guó)各省，威脅著我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此加強(qiáng)PCV2的病原學(xué)檢測(cè)和臨床診斷有重要意義。本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容： 本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增，從河南

3、南陽(yáng)一豬場(chǎng)送檢的疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病豬腹股溝淋巴結(jié)中檢測(cè)到豬圓環(huán)病毒2型（PorcineCircovirusType2，PCV2）核酸，將病料研磨、過(guò)濾除菌后接種無(wú)PCV1和PCV2污染的PK-15細(xì)胞，盲傳8代后用PCR方法仍然能夠在接種細(xì)胞中檢測(cè)到PCV2核酸，PRV、PRRSV、PPV、PCV1的PCR檢測(cè)均為陰性。從接毒細(xì)胞中收獲病毒處理后電鏡觀察，可見(jiàn)到均一的病毒樣粒子，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)也觀察到感染PCV2的P

4、K-15細(xì)胞中的特異性熒光，將該分離株命名為HN-PCV2株。 設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增該分離株的全基因組，與GenBank上已收錄的PCV1和PCV2序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析。序列分析表明，該分離株屬于歐洲分離株系，病毒全基因組長(zhǎng)1767bp，包含11個(gè)開(kāi)放閱讀框，與PCV1的核苷酸同源性是70％左右，與其他PCV2株的同源性介于94.0％～99.2％，ORF1核苷酸同源性介于96.1％～99.7％，氨基酸同源性介于95.2～

5、98.1％，ORF2核苷酸同源性介于92.0％～99.3％，氨基酸同源性介于93.2％～99.1％。 根據(jù)已報(bào)道的豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因組序列，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物，建立一種能夠快速、靈敏地檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的SYBR-GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，溶解曲線特異，相關(guān)系數(shù)為0.9988，最低檢測(cè)的拷貝數(shù)為9拷貝/μL，特異性和重復(fù)性較好。此方法以閉管的模式操作，減少了后續(xù)步驟

6、污染的可能性，整個(gè)PCR檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)3個(gè)小時(shí)。 無(wú)菌采集6頭PMWS患豬的心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟和腹股溝淋巴結(jié)，利用普通PCR對(duì)6頭自然感染PCV2豬的體內(nèi)不同臟器PCV2進(jìn)行定性檢測(cè)，再利用已建立好的實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明，PCV2感染呈多臟器分布，自然感染豬的腹股溝淋巴結(jié)、腎臟和脾臟中病毒含量能達(dá)到7.39×1010拷貝/g、1.80×1012拷貝/g、8.43×109拷貝/g，其次是肺臟，最后是肝臟和