副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(HPS)引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎,隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細菌性疾病。我國是一個養(yǎng)豬大國，但目前仍沒有對副豬嗜血桿菌進行系統(tǒng)研究的報道。本研究對副豬嗜血桿菌的病原學、流行病學、診斷方法和滅活疫苗進行研究，為我國副豬嗜血桿菌病的基礎研究以及我國對于該病的診斷、預防與控制奠定基礎，主要研究內容如下： 1.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及關于我國的病原學調查 從全國十五個

2、省市送本室檢測的疑似患多發(fā)漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎的病料中分離到281株細菌，通過細菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性及PCR鑒定最終確定為副豬嗜血桿菌。對從2003年6月到2004年12月送我室檢測的828例病料進行細菌分離鑒定，結果有183例分離出副豬嗜血桿菌，分離率高達22.1％，表明該菌在我國廣泛流行。對本室分離的所有副豬嗜血桿菌按瓊脂擴散試驗和間接血凝試驗血清學分型方法進行血清型鑒定，結果表明我國以血清4型(24.2％)和5型(19.2

3、％)最為流行，其次為13型(12.5％)、14型(7.1％)和12型(6.8％)，另外有12.1％的分離菌株不能進行血清學分型。該結果為我國對于副豬嗜血桿菌病的預防與控制提供了參考依據(jù)。 2.副豬嗜血桿菌生物學特性的研究 以本室分離鑒定的副豬嗜血桿菌MD0322株和SH0165株為代表菌株對該菌的各種生物學特性進行研究。對不同固體培養(yǎng)基的比較發(fā)現(xiàn)該菌在TSA固體培養(yǎng)基和TM／SN固體培養(yǎng)基上生長最好，對不同液體培養(yǎng)基的比

4、較發(fā)現(xiàn)該菌在TSB液體培養(yǎng)基、TMB液體培養(yǎng)基和BHI液體培養(yǎng)基中生長最好。副豬嗜血桿菌在’TSB液體培養(yǎng)基中的生長曲線顯示培養(yǎng)16～18h活菌數(shù)達到最高峰，隨后大幅下降。副豬嗜血桿菌在生理鹽水、磷酸鹽緩沖液和TSB液體培基中4℃保存的存活曲線顯示該菌在以上介質中每保存一天時間其活菌數(shù)均要下降一個對數(shù)值左右，說明副豬嗜血桿菌通常不能采用單純的平板菌落計數(shù)法活菌計數(shù)。本研究提出的分光光度計測定法合理地解決了副豬嗜血桿菌即時計數(shù)的問題，為該

5、菌各種動物實驗的開展奠定了基礎。 3.副豬嗜血桿菌抗體間接血凝試驗檢測方法的建立及我國血清學調查 將副豬嗜血桿菌經(jīng)超聲波破碎處理后的產(chǎn)物致敏醛化鞣酸化紅細胞，建立間接血凝試驗用于檢測副豬嗜血桿菌抗體。采用該法對副豬嗜血桿菌15種血清型標準血清的檢測結果都為陽性；對豬瘟、口蹄疫、圓環(huán)病毒、細小病毒、豬偽狂犬、豬繁殖與呼吸綜合征、豬氣喘病、豬鏈球菌、豬肺疫巴氏桿菌、豬傳染性萎縮性鼻炎及胸膜肺炎等病原的標準陽性血清的檢測

6、結果全為陰性，具有良好的特異性。本檢測方法最低可檢測出1:2<'11>倍稀釋的高免血清，具有良好的敏感性。按本方法制備的間接血凝診斷試劑保存期可達6個月。本研究為副豬嗜血桿菌抗體的檢測提供了一種簡捷、靈敏和特異的方法。采用該間接血凝試驗檢測方法從2005年3月到2005年12月對全國七個省份共血清1665份的抽檢結果陽性784份，陰性881份，陽性率47.1％，從抗體方面表明副豬嗜血桿菌病在我國各地流行較普遍。 4．副豬嗜血桿菌

7、病滅活疫苗的研究 4．1副豬嗜血桿菌病滅活疫苗制備與檢驗用菌株的篩選 根據(jù)本室完成的副豬嗜血桿菌流行病學調查結果，以我國最流行的血清4型和5型菌株研制疫苗，通過對臨床資料及動物試驗結果的比較篩選出毒力較強，免疫原性較好的菌株即血清4型MD0322株和血清5型SH0165株作為疫苗候選菌株，毒力穩(wěn)定性和免疫原性穩(wěn)定性試驗結果表明兩株菌種連傳25代后仍保持穩(wěn)定，因而最終確定這兩株細菌作為副豬嗜血桿菌病滅活疫苗制備與檢

8、驗用菌株。 4．2副豬嗜血桿菌病滅活疫苗基礎菌種的研究 按照《中國獸用生物制品質量標準》要求建立用于副豬嗜血桿菌病滅活疫苗制備與檢驗用菌株的基礎種子，對基礎菌種的形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特征、血清型、毒力、免疫原性、毒力穩(wěn)定性和免疫原性穩(wěn)定性等進行研究。結果表明基礎菌種在方面均符合副豬嗜血桿菌的特征，MD0322株為血清4型，SH0165株為血清5型，基礎菌種純粹檢驗無雜菌生長，兩株菌種連代25代以后的毒力和免疫原性均保持穩(wěn)

9、定不變，在各方面完全符合基礎菌種的要求。 4．3副豬嗜血桿菌病滅活疫苗安全性試驗 在實驗室試制五批副豬嗜血桿菌病滅活疫苗，批號依次為0301、0302、0303、0304、0305。通過對最小使用日齡靶動物接種、對靶動物各種接種途徑一次單劑量接種，對靶動物單劑量重復接種，對靶動物一次超劑量接種以及對懷孕動物(妊娠母豬)接種后觀察其精神狀態(tài)，體溫和食欲等指標對疫苗的安全性進行了評價，結果表明該疫苗用于豬的免疫是安

10、全的，無副作用。 4．4四種副豬嗜血桿菌病滅活疫苗對仔豬免疫效力的比較 用副豬嗜血桿菌MD0322株和SH0165株兩株菌種分別制備副豬嗜血桿菌病單價滅活疫苗。將兩種單價滅活疫苗與本室試制的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(雙價)，以及國外生產(chǎn)的兩種副豬嗜血桿菌病滅活疫苗相比較，每種滅活疫苗分別免疫28～35日齡仔豬10頭，21日后二免，同時設立10頭未免疫對照。二免后14日，分別用血清4型和5型標準菌株經(jīng)腹腔內攻毒，

11、結果兩種單價疫苗的保護率均為4／5，本室試制的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗總的保護率為9／10，兩種進口疫苗的總保護率分別為8／10(疫苗含血清4型和5型菌)和5／10(疫苗含血清2型和6型菌)。 4．5副豬嗜血桿菌病滅活疫苗效力試驗 通過動物試驗對試制的五批副豬嗜血桿菌病滅活疫苗進行效力檢驗。每批選擇28～35日齡斷奶仔豬20頭，每批疫苗免疫10頭豬，另外10頭作為對照。在二免后14日分別用MD0322株和SH0

12、165株通過腹腔內攻毒，結果免疫豬保護率均在4/5以上，對照組發(fā)病率均在3/5以上，表明試制的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗具有良好的免疫效果。 4.6副豬嗜血桿菌病滅活疫苗的免疫期及抗體消長規(guī)律測定 用本室試制的五批滅活疫苗對其免疫期和免疫豬的抗體消長規(guī)律進行研究。五批疫苗按常規(guī)免疫劑量分別對母豬和14日齡仔豬免疫，于免疫后7、14、28、60、90、120、150、180、2lO日采血測定抗體。結果在疫苗免疫后2周開始檢測出

13、抗體，以后抗體效價逐漸上升，60～120日處于高峰，以后逐漸下降，持續(xù)至免疫后180日。母豬免疫后的抗體消長規(guī)律與仔豬的抗體消長規(guī)律基本一致，但抗體效價高于仔豬。表明副豬嗜血桿菌病滅活疫苗加強免疫后的免疫期可達6個月。 4.7副豬嗜血桿菌母源抗體與仔豬免疫的相關性 將試驗仔豬分成4組，每組10頭。第1組仔豬為未免疫母豬所產(chǎn)，并且仔豬未免疫；第2組仔豬為未免疫母豬所產(chǎn)，但仔豬實行免疫；第3組仔豬為免疫母豬所產(chǎn)，但仔豬未免疫

14、；第4組仔豬為免疫母豬所產(chǎn)的仔豬，并且仔豬實行免疫。分別在仔豬出生后第2、7、14、21、28、35、42和48日采血用間接血凝試驗和瓊脂擴散試驗測定血清抗體效價。通過對抗體檢測結果的比較發(fā)現(xiàn)母源抗體水平在免疫母豬所產(chǎn)仔豬顯著高于非免疫組母豬所產(chǎn)仔豬。另一方面，免疫母豬和非免疫母豬所產(chǎn)仔豬在免疫后所激發(fā)的抗體水平?jīng)]有顯著差異，表明母源抗體對仔豬的免疫不存在影響。 4.8副豬嗜血桿菌病滅活疫苗的保存期試驗 本室試制的五批疫