β-胡蘿卜素和α-生育酚加強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻培育.pdf

1、維生素A和維生素E都是人體必需的微量營養(yǎng)素。維生素A缺乏可引起多種癥狀，最常見的為夜盲癥。在人類飲食中，類胡蘿卜素作為維生素A的唯一前體，其中的β-胡蘿卜素是最主要的維生素A源。而維生素E在防治心腦血管疾病、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、維持人體免疫系統(tǒng)平衡等方面具有廣泛的作用。維生素E包括4種不同形式的生育酚和4種不同形式的生育三烯酚（α-，β-，γ-，δ-生育酚和α-，β-，γ-，δ-生育三烯酚）。α-生育酚具有最高的維生素E活性。

2、>　　 水稻是世界上重要的糧食作物，是世界上超過一半人口的主食。但水稻中缺乏維生素A且α-生育酚含量低，長期只以水稻為主食而不補(bǔ)充其他營養(yǎng)物質(zhì)，將導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏。鑒于以上原因，本研究的目的在于:將玉米來源的八氫番茄紅素合酶基因(psy)和細(xì)菌歐文氏菌來源的八氫番茄紅素脫氫酶基因(crtI)轉(zhuǎn)化到水稻中，在水稻胚乳特異性啟動(dòng)子谷蛋白的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，從而使得β-胡蘿卜素在水稻種子中積累;將玉米來源的γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因(γ-TMT)轉(zhuǎn)化到

3、水稻中，提高水稻種子中α-生育酚的含量;將水稻種子中β-胡蘿卜素積累的psy/crtI轉(zhuǎn)化植株與α-生育酚含量提高的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行雜交，培育成β-胡蘿卜素和α-生育酚加強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻。
　　 本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將psy/crtI轉(zhuǎn)化載體分別轉(zhuǎn)化到粳稻中花11和空育131品種中，將玉米來源的γ-TMT轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化到粳稻中花11品種中。對得到的轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行PCR檢測和Southern

4、blotting檢測。經(jīng)PCR篩選，獲得35株陽性psy/crtI中花11轉(zhuǎn)化植株，17株陽性psy/crtI空育131轉(zhuǎn)化植株，和35株陽性γ-TMT轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)Southernblotting檢測，獲得13株目標(biāo)基因單拷貝的psy/crtI中花11轉(zhuǎn)化植株，6株目標(biāo)基因單拷貝的psy/crtI空育131轉(zhuǎn)化植株，10株目標(biāo)基因單拷貝的γ-TMT轉(zhuǎn)化植株。
　　 2)通過PCR篩選結(jié)合Southernblotting檢測，從p

5、sy/crtI轉(zhuǎn)化植株中分離得到一個(gè)外源基因單拷貝插入的marker-free轉(zhuǎn)基因純合家系ky1-4。通過Tail-PCR的方法分離到其T-DNA插入位點(diǎn)的右側(cè)側(cè)翼序列，又結(jié)合Southernblotting檢測初步分析推測該插入位點(diǎn)位于水稻第11號染色體上。
　　 3)本研究利用超高效液相色譜(UPLC)測定psy/crtI轉(zhuǎn)化植株水稻種子中β-胡蘿卜素含量，不同轉(zhuǎn)基因家系β-胡蘿卜素含量為1.99±0.11～4.41±0.

6、30μg/g，其中marker-free家系ky1-4種子中β-胡蘿卜素含量為3.11±0.08μg/g。
　　 4)篩選出γ-TMT基因的水稻T-DNA插入純合突變體為:5A-3-1、5A-3-15、5A-5-2、5A-5-7、5A-5-16、5A-6-14、5A-6-17、5A-7-12。經(jīng)Southernblotting檢測該突變體含有2個(gè)拷貝的外源T-DNA。利用UPLC測定該突變體的葉片和種子中生育酚的含量，葉片中生育

7、酚含量結(jié)果表明:對照野生型Dongjin品種的葉片中γ-生育酚含量7.62±0.40μg/g，α-生育酚含量312.88±10.86μg/g;然而，突變體5A-5-7、5A-5-16和5A-6-14葉片中α-生育酚含量都為0.00±0.00μg/g，且突變體5A-5-7、5A-5-16和5A-6-14葉片中γ-生育酚含量分別為200.63±4.25μg/g、229.49±10.52μg/g、204.85±24.00μg/g。種子中生育酚

8、含量結(jié)果表明:對照野生型Dongjin品種的種子中γ-生育酚含量0.95±0.05μg/g，α-生育酚含量14.27±0.17μg/g;突變體5A-6-17種子中γ-生育酚含量10.54±0.80μg/g，α-生育酚含量4.41±0.70μg/g;突變體5A-7-12種子中γ-生育酚含量5.77±0.16μg/g，α-生育酚含量10.52±0.08μg/g。
　　 5)利用UPLC測定γ-TMT轉(zhuǎn)化植株葉片和種子中生育酚的含量，