芝麻EST-SSR開發(fā)、遺傳圖譜構建及棉花脂肪酸代謝相關基因克隆.pdf

1、芝麻是重要的油料作物。與其他作物相比，芝麻的分子生物學研究剛剛起步，有關其圖譜構建和轉基因的研究還未見報道；棉花是重要的經(jīng)濟作物，棉籽中富含蛋白質(zhì)和脂肪。近年來在棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)改良方面的分子生物學研究已取得較多成果，但在脂肪酸代謝基因工程改良棉籽油組分及植株抗寒性等方面的研究卻相對缺乏。為此本文開展了芝麻分子遺傳圖譜構建和棉花重要脂肪酸代謝相關基因的克隆研究。為今后芝麻標記輔助選擇育種、QTL定位、圖位克隆、以及芝麻和棉花的轉基因育種

2、和比較基因組學研究奠定基礎。研究結果如下： 1、芝麻分子標記的開發(fā) 鑒于在構建芝麻分子遺傳圖譜時缺乏足夠的可利用分子標記，本研究進行了基于芝麻轉錄組和基因組的分子標記開發(fā)與研究工作，一方面，利用現(xiàn)有的芝麻EST(expressed sequence tags)數(shù)據(jù)信息，在分析其中SSR(simple sequence repeat)分布特征的同時，開展芝麻EST-SSR功能性標記的開發(fā)和利用研究，在所有的3328條芝麻E

3、ST序列中共確認得到1785條非冗余EST序列。非冗余EST序列總長為774.266kb，平均每3.06 kb含有一個EST-SSR。EST-SSR的分布頻率和特征分析表明，在所有≥18個核苷酸類型的重復基元中，二核苷酸重復基元出現(xiàn)的頻率最高(50％)，五核苷酸重復基元出現(xiàn)的頻率最低(2.2％).二核苷酸重復基元中又以AG/TC為重復基元(motif)的SSR出現(xiàn)最多，占總SSR的37.42％。利用含有SSR的EST序列，本文共設計開發(fā)

4、了120對EST-SSR引物。另一方面，在分析前人發(fā)明的SAMPL標記的基礎上，本研究開發(fā)了一種可廣泛應用于各物種的新型、高效的分子標記，即RSAMPL(Random Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci)標記。該標記是AFLP標記技術的延伸，在AFLP標記技術最后的選擇性擴增環(huán)節(jié)，采用一個AFLP引物與一個SSR引物來進行組配擴增.因該標記中SSR引物的來

5、源既不受物種間限制，也不受SSR引物來源限制，其引物組合幾乎是無限的，可遍及整個基因組，作為一種新的標記資源在基因組信息缺乏的物種中研究應用。 2、芝麻分子遺傳圖譜的構建 利用兩個不同來源的芝麻栽培品種(中油所品種1134和四川榮縣黑芝麻)組建了含96個單株的F2分離群體，通過EST-SSR、RSAMPL和AFLP標記在親本及F2分離群體篩選，構建了第一張芝麻分子遺傳圖譜。該圖譜包含30個連鎖群，220個分子標記，標記間

6、平均間隔為4.93cM，共覆蓋936.72cM的遺傳距離。連鎖群上的標記數(shù)在2-33之間，平均每個連鎖群上有7.33個標記。各連鎖群長度在6.44-74.52cM之間，平均長度為31.22cM。基于圖譜信息，本文首次對芝麻基因組的遺傳距離進行估計，大小為1232.53cM，所構建連鎖圖譜的基因組覆蓋率為76％。作為芝麻屬，同時也是胡麻科第一張的分子遺傳圖譜，該圖譜是芝麻基因組研究的起點，不僅對芝麻今后的基因組研究產(chǎn)生積極而深遠的影響，而

7、且也為進一步的圖位克隆、種質(zhì)創(chuàng)新和分子標記輔助育種等研究提供可能。 3、棉花與脂肪酸代謝相關基因的克隆 在深入了解植物脂肪酸代謝網(wǎng)絡的基礎上，本研究根據(jù)擬南芥、油菜等作物脂肪酸代謝關鍵酶基因的序列信息設計簡并引物在棉花cDNA中進行同源克隆，并利用電子拼接和RACE技術，首次分離、克隆了七個在脂肪酸代謝過程中起重要作用的基因：(1)β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)基因。該基因長為2085bp，開放閱讀框長為1731

8、bp；共編碼576個氨基酸。BlastP結果顯示，該棉花序列與已報道的大豆(Glycinemax)、油菜(Brassica napus)、向日葵(Helianthus annuus)的β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)分別有93％、91％和88％的同源性；(2)β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅲ(KASⅢ)基因。該基因長為1751bp，開放閱讀框長為1206bp；共編碼401個氨基酸。BlastP結果顯示，該棉花序列與已報道的蓖麻(Rici

9、nus communis)、紫蘇(Perilla futescens)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)的β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅲ(KASⅢ)分別有89％、88％和85％的同源性。(3)ω-3脂肪酸脫飽和酶(ω-3FAD)基因。該基因長為1905bp，開放閱讀框長為1341bp；共編碼446個氨基酸。BlastP結果顯示，該cDNA序列與已報道的煙草(Nicotiana tabacum)、向日葵(Helianthus

10、 annuus)和擬南芥(Arabidopsisthatiana)的ω-3脂肪酸脫飽和酶(ω-3 FAD)分別有84％、82％和78％的同源性。(4)甘油-3磷酸酰基轉移酶(GPAT)基因。該基因長為1845bp，開放閱讀框長為1503bp；共編碼500個氨基酸。BlastP結果顯示，該cDNA序列與已報道的擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryza sativa(japoIuca cultivar-group)

11、)的甘油-3-磷酸?；D移酶(GPAT)分別有91％和78％的同源性。(5)4-香豆素：CoA連接酶(4CL)基因。該基因長為1909bp，開放閱讀框長為1725bp；共編碼574個氨基酸。BlastP結果顯示，該cDNA序列與已報道的茶(Camellia sinensis)、大豆(Glycine max)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的4-香豆素：CoA連接酶(4CL)分別有88％、87％和82％的同源性。(6

12、)脂酰-CoA氧化酶(ACX)基因。該基因長為2268bp，開放閱讀框長為1995bp；共編碼664個氨基酸。BlastP結果顯示，該cDNA序列與已報道的番茄(Lycopersicon Esculentum)、葡萄(Vitis vinifera)和大豆(Glycine max)的脂酰-CoA氧化酶(ACX)分別有92％、92％和91％的同源性。(7)β-氧化多功能蛋白質(zhì)(MFP)基因。該基因長為2455bp，開放閱讀框長為2166bp

13、；共編碼721個氨基酸。BlastP結果顯示，該cDNA序列與已報道的葡萄(Vtis vinifera)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa(japoIuca cultivar-group))的β-氧化多功能蛋白質(zhì)分別有89％、86％和83％的同源性。通過綜合比較分析，初步預測在上述基因中，基因1-4參與脂肪酸合成代謝，它們調(diào)控貯脂和膜脂的生物合成，可能在種子脂肪酸合成的效率和比例以及棉花