稻瘟病菌鈣-鈣調(diào)素依賴蛋白激酶基因功能的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室前期研究從稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)PO-41菌株中克隆到兩個(gè)鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase，CaMK)基因，分別命名為MgCaMK1和MgCaMK2。兩個(gè)基因在基因組中為單拷貝基因。激酶活性實(shí)驗(yàn)表明：MgCaMK1為鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶，而MgCaMK2為鈣依賴蛋白激酶(CDPK)。 本研究的主要目的是明確CaMK在稻瘟病

2、菌菌絲生長及致病過程中的作用。主要結(jié)果如下： (1)分別構(gòu)建了稻瘟病菌CaMK1和CaMK2基因敲除載體并進(jìn)行了驗(yàn)證。 (2)利用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將構(gòu)建好的敲除載體轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌原生質(zhì)體中。CaMK1基因共獲得14個(gè)轉(zhuǎn)化子。采用潮霉素抗性及PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩，獲得8個(gè)含抗潮霉素基因的轉(zhuǎn)化子。Southern雜交驗(yàn)證表明，7個(gè)轉(zhuǎn)化子為異位整合轉(zhuǎn)化子，另一個(gè)轉(zhuǎn)化子同源片段不僅沒有替換掉目的基因也沒有插入到該轉(zhuǎn)化子

3、的基因組DNA中?？赡茉颍阂皇荘EG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)同源重組效率較低，需大量篩選才能得到基因敲除突變子；二是CaMK1在基因組中為單拷貝基因，敲除可能足導(dǎo)致致死突變。對其中兩個(gè)異位整合的轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)性狀進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)化子K1-1菌落顏色始終為米黃色，其平均生長速率要高于野生型，但是產(chǎn)孢量沒有明顯差異，孢子萌發(fā)時(shí)較野生型延遲，且萌發(fā)率很低，但24 h后觀察有附著胞出現(xiàn)。轉(zhuǎn)化子K1-2生物學(xué)性狀與野生型無顯著差異。 (3