山麻鴨睪丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分離純化與性質(zhì)研究.pdf

1、通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-32陰離子交換柱、Sephacryl S-300分子篩柱，從山麻鴨睪丸中提取出N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，EC3.3.1.52，簡稱NAGase)，比活力為5537.00 U/mg。提取的酶液經(jīng)PAGE檢測，呈現(xiàn)一條蛋白條帶，經(jīng)SDS-PAGE平板電泳呈現(xiàn)1種蛋白條帶，亞基分子質(zhì)量為67.60kD，等電點(diǎn)為5.05。以對-硝基苯-N-乙酰-β-

2、D-氨基葡萄糖(pNP-NAG)為底物，進(jìn)行酶催化底物水解的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果表明：山麻鴨睪丸NAGase催化底物反應(yīng)的最適pH是5.70，在pH3.0～8.43區(qū)域較穩(wěn)定；最適溫度分別為45℃，酶活力在5℃～45℃的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。睪丸NAGase水解pNP-NAG的反應(yīng)符合米氏雙曲線方程，水解pNP-NAG的米氏常數(shù)Km為0.17 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vm為8.82μmol/L/min，反應(yīng)的活化能為57.57 kJ/mol

3、。 研究金屬離子對睪丸NAGase的影響，結(jié)果表明：低濃度(1～20mmol/L)的Na+對酶有激活作用。K+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和高濃度(0.02～1 mol/L)Na+對酶活力有不同程度的抑制作用。Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和高濃度K+對酶的抑制都表現(xiàn)為可逆非競爭性抑制類型，K+、Cu2+、Zn2+、Mg2+和Ca2+對酶的抑制常數(shù)KI分別為1.27 mol/L、20.91、40.43、1.9

4、5和108.12 mmol/L。 在特定濃度范圍內(nèi)，果糖、乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和蔗糖對睪丸NAGase活力有不同程度的抑制作用，果糖和乳糖的抑制作用較弱，葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和蔗糖對酶的抑制作用強(qiáng)。葡萄糖對酶的抑制表現(xiàn)為可逆非競爭性類型，它的抑制常數(shù)K1為153.37 mmol/L；N-乙酰-D-氨基葡萄糖對酶的抑制類型是可逆混合型抑制類型，抑制常數(shù)KI與KIS分別為5.17和12.52 mmol/

5、L；蔗糖對酶的抑制表現(xiàn)為可逆非競爭性類型，它的抑制常數(shù)KI為1.69mol/L。 研究常用的精液稀釋液成份谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、維生素C、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉對酶的作用，結(jié)果表明谷氨酸鈉和磷酸二氫鈉對山麻鴨睪丸NAGase有抑制作用；檸檬酸鈉和磷酸氫二鈉對酶活力的影響均是先激活后抑制；維生素C對酶有很強(qiáng)的激活作用。磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉對酶的抑制都屬于可逆混合型抑制類型，抑制常數(shù)KI與KIS分別為36.55、210.7 mmol

6、/L和94.65、273.06 mmol/L。 以非極性氨基酸：丙氨酸(L-Ala)、纈氨酸(L-Val)、苯丙氨酸(L-Phe)、蛋氨酸(L-Met)、脯氨酸(L-Pro)；極性氨基酸：甘氨酸(L-Gly)、蘇氨酸(L-Thr)、絲氨酸(L-Ser)、谷氨酰胺(L-Gln)；堿性氨基酸：精氨酸(L-Arg)、組氨酸(L-His)和賴氨酸(L-Lys)作為效應(yīng)物，測定氨基酸對山麻鴨睪丸NAGase活力的影響。L-Ala、L-Va