棉花、煙草響應(yīng)低溫脅迫的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、植物在長期的進(jìn)化過程中具備了各種不同的生理生化機(jī)制，以抵抗、適應(yīng)各種逆境。在眾多非生物脅迫中，低溫是限制許多重要作物產(chǎn)量和分布的重要環(huán)境因素。植物通過改變形態(tài)、生理和生化過程，使脅迫應(yīng)答基因表達(dá)，合成特殊的蛋白質(zhì)來響應(yīng)低溫脅迫。到目前為止，關(guān)于低溫脅迫對植物生長發(fā)育以及各種代謝活動影響產(chǎn)生的機(jī)理還不清楚。本研究利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略首次對低溫脅迫下棉花幼苗、煙草懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)組變化以及外源轉(zhuǎn)錄因子CBF1A表達(dá)對煙草懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影

2、響進(jìn)行了研究，以期為揭示植物對低溫脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制提供依據(jù)。 1、利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法(TCA/acetone precipitation)提取棉花幼苗總蛋白質(zhì)，建立了棉花幼苗蛋白質(zhì)雙向電泳體系；雙向電泳凝膠經(jīng)銀染和考馬斯亮藍(lán)R-350熱染，掃描獲取電泳圖片，利用ImageMaster2DPlatium Software分析比較低溫脅迫處理幼苗與未低溫處理幼苗的蛋白質(zhì)組差異；發(fā)現(xiàn)銀染的凝膠中有54個

3、差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中29個蛋白點(diǎn)在低溫處理后表達(dá)量升高，25個蛋白點(diǎn)表達(dá)量降低；利用質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定出其中的8個差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中的7個蛋白點(diǎn)被鑒定為同一種蛋白β-球蛋白，另一種蛋白鑒定為Rubisco大亞基；通過對棉花子葉生理生化指標(biāo)的測定發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會引起棉花幼苗子葉肽鏈內(nèi)切酶活性的增強(qiáng)；子葉凈光合速率和羧化效率降低；棉花子葉內(nèi)活性氧產(chǎn)生速率升高，脂質(zhì)過氧化加速?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為低溫脅迫會加速β-球蛋白和Rubisco大亞

4、基的降解，并對蛋白的降解模式進(jìn)行了分析。本文為從分子水平上揭示棉花幼苗低溫響應(yīng)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，為深入了解低溫脅迫下蛋白的降解機(jī)制提供了依據(jù)。 2、利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法提取煙草懸浮細(xì)胞總蛋白質(zhì)，建立了煙草懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳體系；分析比較了煙草懸浮細(xì)胞在低溫脅迫處理后蛋白質(zhì)組的變化，通過對差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的鑒定，發(fā)現(xiàn)LEA-類似蛋白NtLEA7-3的豐度在低溫處理后上調(diào)，為低溫誘導(dǎo)表達(dá)升高蛋白。通過

5、熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下該蛋白mRNA水平變化與蛋白表達(dá)水平變化情況基本一致。利用RACE技術(shù)得到NtLEA7-3基因全長cDNA(GenBank登錄號：EF532409)。NtLEA7-3 cDNA全長為1267 bp，該序列含有一個969 bp的完整開放讀碼框，編碼322個氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量約為35.7 kDa，等電點(diǎn)為4.86。對NtLEA7-3編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明，該蛋白富含無規(guī)卷曲(Coil)，高達(dá)6

6、5.31％，其次是α-螺旋(Helix)，為19.69％，而β-折疊(Strand)只有15.00％。將NtLEA7-3編碼區(qū)插入原核表達(dá)載體pET30a(+)，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，NtLEA7-3融合蛋白在BL21菌株中成功表達(dá)。將得到的NtLEA7-3編碼區(qū)插入植物表達(dá)載體pBI121中，構(gòu)建了NtLEA7-3植物表達(dá)載體pBI121-LEA；成功地將其轉(zhuǎn)入到煙草和懸浮細(xì)胞中，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株及懸浮細(xì)

7、胞，通過對轉(zhuǎn)基因植株及懸浮細(xì)胞的表型和低溫脅迫下生理生化特征分析表明，NtLEA7-3成功地表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株和懸浮細(xì)胞的耐低溫脅迫能力。將NtLEA7-3編碼區(qū)插入含有GFP基因的植物表達(dá)載體pBI121中，構(gòu)建了NtLEA7-3-GFP的植物表達(dá)載體pBI121-LEA-GFP，成功地將NtLEA7-3-GFP融合基因轉(zhuǎn)入擬南芥和煙草懸浮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NtLEA7-3定位于細(xì)胞核中。本文不僅為研究植物的抗逆機(jī)理提供了參考，為植物抗性

8、育種提供了有效的候選基因，同時為深入研究NtLEA7-3的結(jié)構(gòu)、功能和分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 3、成功地將棉花低溫脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CBF1A基因轉(zhuǎn)入了煙草懸浮細(xì)胞中，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略分析了轉(zhuǎn)CBF1A基因煙草懸浮細(xì)胞和野生型煙草懸浮細(xì)胞的蛋白質(zhì)組差異，發(fā)現(xiàn)外源CBF1A基因的表達(dá)會引起煙草懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化，有7個蛋白點(diǎn)表達(dá)差異顯著，其中4個蛋白點(diǎn)表達(dá)升高，3個蛋白點(diǎn)表達(dá)降低。利用質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定出其中6個蛋白點(diǎn)，代