豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體ELISA檢測(cè)與基因免疫研究.pdf

1、流產(chǎn)嗜性衣原體（Chlamydophila abortus，CAB）是引起豬、牛、羊等多種動(dòng)物流產(chǎn)、死胎、弱胎等慢性接觸性疾病的一種重要病原體，孕婦也可感染而發(fā)生流產(chǎn)。建立準(zhǔn)確、快速的診斷方法和研制安全、高效的疫苗是預(yù)防和控制本病的重要措施。本研究應(yīng)用PCR技術(shù)獲得CAB主要外膜蛋白（MOMP）全長(zhǎng)基因和四種不同片段大小多型性外膜蛋白90（POMP90）的編碼基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行原核表達(dá)獲得重組蛋白，探討了其在豬CAB感染血清學(xué)

2、檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，建立了豬CAB間接ELISA抗體檢測(cè)方法；并構(gòu)建了momp基因真核表達(dá)質(zhì)粒，及細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ編碼基因與momp基因真核共表達(dá)質(zhì)粒，比較了pcDNA3.1和PCI-neo兩種真核表達(dá)載體基因免疫效應(yīng)的差異，探索了細(xì)胞因子和中藥提取成分枸杞多糖對(duì)基因免疫的佐劑效應(yīng)。
　　 1．本研究根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì)引物，以流產(chǎn)嗜性衣原體CP/12株的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增了momp全長(zhǎng)基因和四種不同片段大小的

3、pomp90基因，與pMD18-T載體連接后進(jìn)行測(cè)序鑒定。將目的基因與原核表達(dá)載體pGEX-KG進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌E．coli BL21中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot檢測(cè)分析，結(jié)果表明具有較強(qiáng)的免疫原性。進(jìn)而以純化后的五種重組蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA抗體檢測(cè)方法，并對(duì)臨床血清進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，重組MOMP蛋白不適合于建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法，而四種重組POMP蛋白建立的間

4、接ELISA抗體檢測(cè)方法均具有靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，且克服了傳統(tǒng)間接血凝試驗(yàn)低靈敏度、判斷主觀性強(qiáng)等缺點(diǎn)。
　　 2．將momp基因分別克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1和PCI-neo，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-MOMP和PCI-MOMP，并進(jìn)行了小鼠免疫試驗(yàn)，比較不同真核表達(dá)載體構(gòu)建基因疫苗免疫效應(yīng)的差異。結(jié)果表明，PCI-MOMP可誘導(dǎo)更高的體液免疫效應(yīng)和微弱的細(xì)胞免疫，但未觀察到更有效的免疫保護(hù)。

5、>　　 3．將獲得的豬IL-2和IFN-γ編碼基因插入真核表達(dá)質(zhì)粒PCI-MOMP中構(gòu)建真核共表達(dá)質(zhì)粒，并通過小鼠接種試驗(yàn)評(píng)價(jià)了兩種細(xì)胞因子通過真核表達(dá)質(zhì)粒混合免疫和基因共表達(dá)對(duì)基因免疫的佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明，兩種細(xì)胞因子既不能增強(qiáng)體液免疫效應(yīng)，也未觀察到增強(qiáng)的細(xì)胞免疫效應(yīng)和有效的免疫保護(hù)。
　　 4．將中藥提取成分枸杞多糖與真核表達(dá)質(zhì)粒PCI-MOMP同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，評(píng)價(jià)了枸杞多糖對(duì)基因免疫的佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明1，枸杞多糖