桑樹黃化型萎縮病植原體致病相關(guān)蛋白基因的克隆及致病性分析.pdf

1、植原體病害是世界性植物病害，桑黃化型萎縮病是由植原體引起的桑樹重大病害，常導(dǎo)致大片桑樹毀滅，嚴(yán)重制約了蠶桑業(yè)的發(fā)展。由于植原體分離、培養(yǎng)困難，植原體致病的分子機制目前仍不清楚。本研究利用基因同源克隆技術(shù)分離到桑樹植原體致病相關(guān)蛋白基因MPEP和MDPH，對其編碼蛋白進行了生物信息學(xué)分析，并初步探討了其致病性，為從分子水平上揭示桑樹植原體的致病機制奠定了基礎(chǔ)，同時為植原體病害的防治技術(shù)研究提供了參考。
　　 1、利用同源克隆技術(shù)分

2、離得到桑樹黃化型萎縮病植原體效應(yīng)蛋白MPEP基因(GenBank注冊號：HM153427)，MPEP全長213bp，編碼70個氨基酸；MPEP理論分子質(zhì)量為8.19kDa，等電點為5.45，屬酸性蛋白，其氨基酸序列與其他植原體中已分離的同源蛋白具有很高的同源性；結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明：MPEP二級結(jié)構(gòu)富含α-螺旋，其次是β-折疊，含有少量的無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角；MPEP的理化特征預(yù)測表明：該蛋白有明顯信號肽序列和一個跨膜區(qū)，顯示較強的親水性，為

3、分泌蛋白;將去掉終止密碼子的MPEP編碼框插入含GFP基因的原核穿梭表達載體pBBR1MCS-5，轉(zhuǎn)化桑樹內(nèi)生枯草芽孢桿菌Lu-144，在Lu-144發(fā)酵液上清液中檢測到GFP熒光信號，初步證實了MPEP的分泌性；將MPEP編碼區(qū)插入原核表達載體pET30a(+)構(gòu)建了原核表達載體pET30a-MPEP-GFP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，MPEP在BL21菌株發(fā)酵液上清液中成功表達，進一步證實MPEP的分泌性；將不含終止密碼

4、子的MPEP編碼框插入含GFP基因的植物表達載體pBI121，構(gòu)建了MPEP-GFP的植物表達載體pBI121-MPEP-GFP，成功地轉(zhuǎn)入擬南芥和洋蔥表皮細胞，發(fā)現(xiàn)表達的MPEP蛋白定位于植物細胞質(zhì)內(nèi)；將MPEP編碼區(qū)插入植物表達載體pBI121，構(gòu)建了MPEP的植物表達載體pBI121-MPEP，成功地將MPEP基因轉(zhuǎn)入擬南芥，通過對轉(zhuǎn)基因植株表型和生理生化特征分析表明，MPEP表達可引起植株出現(xiàn)典型的植原體病害病癥；通過GC-MS

5、分析發(fā)現(xiàn)MPEP在擬南芥植株中表達引起擬南芥代謝組發(fā)生明顯變化，其中糖類、有機酸類、氨基酸類、醇類和烴類等物質(zhì)含量變化顯著。本研究為深入探討桑樹植原體效應(yīng)蛋白MPEP的致病性及植原體的致病機制奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、利用同源克隆技術(shù)克隆得到桑樹黃化型萎縮病植原體溶血素蛋白基因MDPH(GenBank登錄號：HQ891118)。MDPH全長717bp，編碼238個氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為27.3kDa，等電點為9.29，其氨基

6、酸序列與其他植原體中已分離的溶血素蛋白有很高的同源性；MDPH的結(jié)構(gòu)預(yù)測表明：該蛋白的二級結(jié)構(gòu)富含α-螺旋，其次為β-折疊和無規(guī)卷曲，而轉(zhuǎn)角僅占5.46％；蛋白質(zhì)的理化特征預(yù)測表明：該蛋白具有多個親水和疏水區(qū)域，且疏水性強于親水性，易形成跨膜螺旋，具有7個顯著跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)；蛋白的抗原性較強，不含有明顯的信號肽序列；將MDPH編碼區(qū)插入原核表達載體pET30a(+)，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，MDPH在BL21菌株中