家蠶絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶BmSHMT的鑒定及酶活性質(zhì)研究.pdf

1、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（Serine hydroxymethyltransferase，SHMTs，EC:2.1.2.1）是5-磷酸吡哆醛(PLP)依賴的天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶類超家族酶Ⅰ類折疊型成員，廣泛存在于真核生物、原核生物和古細菌中。在酶的同源異途進化過程中氨基酸序列高度保守，同時卻有底物的多樣性。SHMT的主要功能是催化絲氨酸和四氫葉酸向甘氨酸和N5，N10-亞甲基四氫葉酸的可逆轉(zhuǎn)化。該反應(yīng)是一碳單位的主要來源，參與神經(jīng)遞質(zhì)、胸苷酸、嘌呤

2、類衍生物和甲硫氨酸的合成。SHMT在植物的光氧化呼吸作用、癌細胞的調(diào)控、抗逆抗病蟲害方面有重要作用，并已成為一種研究酶的催化機制以及蛋白結(jié)構(gòu)調(diào)控機制的模式酶。
　　家蠶絲由絲素和絲膠構(gòu)成，絲素以甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸的含量為最多。家蠶體內(nèi)合成甘氨酸的酶系活性比合成丙氨酸的酶系活性高，這與家蠶絲素中甘氨酸含量最高的特點相一致。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的生理底物是甘氨酸和絲氨酸。研究家蠶絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因(BmSHMT)有助于深

3、入理解家蠶合成絲蛋白時的氨基酸供應(yīng)機制。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.BmSHMT基因的生物信息學(xué)分析及表達特征
　　利用從NCBI上下載的人細胞質(zhì)型SHMT氨基酸序列檢索家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，預(yù)測得到了候選基因BGIBMGA007079-TA，將其命名為BmSHMT，將BGIBMGA007079-TA氨基酸序列重新在NCBI中進行BLASTP，發(fā)現(xiàn)NCBI中關(guān)于BmSHMT基因序列只有一條報告，序列號為NP_0010

4、40279.1。利用BioEdit軟件預(yù)測BmSHMT基因的ORF序列，得到長度為1398 bp的全長序列。BmSHMT基因定位于家蠶第17號染色體的nscaf2865上，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，共編碼465個氨基酸，理論分子量約為53 kDa，等電點pI為7.56。結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示BmSHMT蛋白序列含有SHMT家族結(jié)構(gòu)域，無信號肽和跨膜區(qū)。
　　利用ClastalX軟件將BmSHMT與已報道的SHMT家族成員進行氨基酸序列

5、比對，然后使用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，運用GENEDOC軟件導(dǎo)出氨基酸序列比對結(jié)果。結(jié)果顯示，構(gòu)建的進化樹大致分為4大簇，昆蟲、哺乳動物、植物以及原核生物分別聚為一簇，家蠶BmSHMT基因和黑脈金斑蝶SHMT基因同源性最高。氨基酸序列比對結(jié)果顯示SHMT在已選物種中具有較高的序列保守性。
　　利用qRT-PCR對BmSHMT基因不同組織和不同時期的表達特征進行分析，發(fā)現(xiàn):BmSHMT基因在家蠶表皮、脂肪體和絲腺，尤其是后部絲

6、腺中表達量很高。SHMT基因在872品種后部絲腺的表達量比前中部絲腺高，并且這種差異與大造品種相比更加明顯。SHMT基因在Nd品種整條絲腺中的表達量與872和大造品種前中部絲腺的表達水平接近。BmSHMT基因在食桑期的表達量比眠期高。BmSHMT基因在家蠶五齡前期表達量高，且呈逐漸降低的狀態(tài)，在預(yù)蛹期表達量又變高。
　　對BmSHMT基因的5'上游2kb長度的核酸序列進行分析，發(fā)掘影響B(tài)mSHMT基因的相關(guān)因素。啟動子序列分析和轉(zhuǎn)

7、錄因子結(jié)合位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)BmSHMT基因上游無典型的TATA盒和CAAT盒，無CpGF島。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點大概分為三類:細胞生長分化因子、應(yīng)急脅迫和免疫相關(guān)的因子以及激素調(diào)控因子。HSF轉(zhuǎn)錄因子多次重復(fù)出現(xiàn)，BR-C Z轉(zhuǎn)錄因子也得到關(guān)注。
　　2.家蠶BmSHMT基因的全長克隆、原核表達純化及多克隆抗體制備
　　以從家蠶大造品種的五齡3天脂肪體中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，克隆得到1398 bp的全長序列。

8、　　構(gòu)建融合蛋白表達載體BmSHMT-pET28a，在BL21(DE3)表達菌株中表達，經(jīng)16℃，20 h誘導(dǎo)表達出可溶的BmSHMT重組蛋白。重組蛋白經(jīng)過鎳柱純化，在200 mM咪唑濃度下可以洗脫得到較純的目的蛋白，進一步經(jīng)過分子篩純化和30K超濾管濃縮，獲得了純度約90％的蛋白，送制兔抗BmSHMT商業(yè)化多克隆抗體，制備的抗體效價為1∶100000。
　　3.BmSHMT的Western blot驗證和亞細胞定位
　　使

9、用制備的BmSHMT多克隆抗體，通過western blot在蛋白水平上驗證BmSHMT的組織差異性。結(jié)果顯示BmSHMT在絲腺和脂肪體中表達量較高，這與qRT-PCR結(jié)果一致。
　　在中部絲腺和后部絲腺進行BmSHMT的免疫熒光定位，與對照相比，后部絲腺的熒光信號明顯強于中部絲腺。
　　4.家蠶BmSHMT的酶活檢測
　　SHMT的基本功能是催化絲氨酸和四氫葉酸向甘氨酸和N5，N10-亞甲基四氫葉酸的可逆轉(zhuǎn)化。根據(jù)實

10、驗室條件選擇分光光度法測定BmSHMT的酶活。檢測方法如下:在30℃，pH為8.5的反應(yīng)條件下將BmSHMT和亞甲基四氫葉酸脫氫酶2(BmMTHFD-2)偶聯(lián)起來，檢測NADPH的吸光度在340 nm(消光系數(shù)為6.22mM·L-1·cm-1)處1 min內(nèi)的變化，進而間接計算出BmSHMT的酶活。Ser和THF的最大濃度分別為5 mM和400μM，并建立一系列底物濃度梯度，測定L-Ser和THF的Km值。酶活測定結(jié)果顯示，當(dāng)BmSHM

11、T的酶濃度為0.002 mg/mL，MTHFD-2的蛋白濃度為4 mg/mL時，BmSHMT的酶活為1.32±0.26μM·min-1·mg-1。利用Origin軟件根據(jù)米氏方程推導(dǎo)出Km L-serine為0.52±0.23 mM， Km THF為0.07±0.04mM。BmSHMT的酶活測定結(jié)果和已有報道的其他物種SHMT的酶活比較后發(fā)現(xiàn)，其和人類細胞質(zhì)SHMT型的酶活相當(dāng)。
　　5.家蠶BmSHMT的定點突變及酶活測定

12、>　　比較家蠶和人細胞質(zhì)型SHMT(HcSHMT)的氨基酸序列，并查閱已有的SHMT突變研究相關(guān)的文獻報道，選擇有研究意義的突變位點。通過一步定點突變法和重疊PCR法對BmSHMT的特定位點進行定點突變，獲得BmSHMT(H132D)和BmSHMT(P246C)等突變體。對其測定酶活發(fā)現(xiàn)，它們的酶活均為0.32±0.08μM·min-1·mg-1，明顯低于野生正常型BmSHMT的酶活。PBS緩沖液(pH8.2)中，BmSHMT(H132