雞白痢沙門氏菌基因組文庫的構(gòu)建及其必需基因的篩選.pdf

1、雞白痢沙門氏菌是腸桿菌科沙門氏菌屬的成員，對禽類具有高度的適應性和專嗜性，是目前危害世界養(yǎng)雞業(yè)的病原之一。近年來，雞白痢沙門氏菌的耐藥性逐漸增強，急需開發(fā)安全、高效、種屬特異的抗菌藥物。
　　 必需基因是維持一個細胞的生命活動所必不可少的基因，去除一個必需基因或者使其不表達或產(chǎn)物失活均會使一個生物體無法繼續(xù)存活，所以微生物必需基因的翻譯產(chǎn)物就有可能成為抗細菌藥物的靶點。
　　 本實驗采用用隨機PCR的方法獲得雞白痢沙門氏

2、菌基因組的隨機片段，將隨機片段與pIDM1質(zhì)粒連接，該質(zhì)粒含有一個溫度敏感復制起始蛋白RepAts，導致其在30℃能復制，而在37℃不能復制。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1，共獲得約5×105個克隆。肉眼目測藍白斑比例約為1:9，隨機挑取菌落，應用PCR方法進行復核，結(jié)果文庫目的片段的插入率為90％(9/10)。將合并所有克隆抽提的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入雞白痢沙門氏菌，得到約5×105個克隆，隨機挑取白色菌落，接種于含四環(huán)素的培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)30h，

3、作適當稀釋后涂布于四環(huán)素平板，37℃培養(yǎng)48h，重復驗證平板上有無細菌生長，以判定插入片段的必需性。
　　 如果37℃平板上有細菌生長，則該菌株所含質(zhì)粒的克隆片段為非必需基因片段，選取篩選的非必需基因gidA，設計引物擴增其不同長度的片段，與pIDM-T連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)入本菌株，轉(zhuǎn)換溫度培養(yǎng)測定不同片段的IPC值；反之，37℃平板上無細菌生長，則該菌株所含質(zhì)粒的插入片段為必需基因部分或空載體。實驗從12384