丁草胺對(duì)斑馬魚的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究.pdf

1、丁草胺屬于酰胺類除草劑，它通過抑制雜草體內(nèi)蛋白質(zhì)合成而起到除草作用。斑馬魚具有產(chǎn)卵量多、前期胚胎透明、繁殖快、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，成為繼小鼠、果蠅、線蟲之后又一新型模式生物。本論文采用魚類活體(In vivo)實(shí)驗(yàn)方法，以丁草胺原藥（我國(guó)應(yīng)用最多的三個(gè)除草劑之一）為供試藥劑，從下丘腦-垂體-甲狀腺軸、下丘腦-垂體-性腺軸和氧化損傷等角度，研究丁草胺對(duì)斑馬魚內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 丁草胺對(duì)斑馬魚成魚的急性毒性結(jié)

2、果顯示:丁草胺對(duì)斑馬魚成魚96h的LC50值是0.49 mg/L，根據(jù)農(nóng)業(yè)部《農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)準(zhǔn)則》農(nóng)藥對(duì)魚類毒性等級(jí)的劃定標(biāo)準(zhǔn)，表明丁草胺對(duì)斑馬魚咸魚的毒性為高毒。采用GC-MS\MS對(duì)丁草胺原藥中的雜質(zhì)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，96％丁草胺原藥中主要雜質(zhì)是二丁氧基甲烷和(2-氯-N-(2，6-二乙基苯基)乙酰胺。我們測(cè)定了斑馬魚整個(gè)生命周期中的甲狀腺激素變化動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明斑馬魚的胚胎在28±1℃條件下，受精后48～72 h內(nèi)孵化，授精后0-

3、3天胚胎孵化前T4和T3的含量沒有顯著變化;幼魚體內(nèi)T3含量在授精后第10天達(dá)到最高峰;幼魚體內(nèi)T4含量在授精后第21天達(dá)到最高峰。在斑馬魚生長(zhǎng)后期，甲狀腺激素會(huì)出現(xiàn)一個(gè)低平臺(tái)期，本研究為將來選用斑馬魚進(jìn)行污染物的內(nèi)分泌干擾研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 從下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT)調(diào)控角度出發(fā)，研究了丁草胺對(duì)斑馬魚幼魚和成魚體長(zhǎng)、體重和生長(zhǎng)因子等形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響;運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測(cè)丁草胺對(duì)斑馬魚成魚血漿和幼魚

4、組織中甲狀腺激素水平的影響;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)丁草胺對(duì)斑馬魚幼魚甲狀腺軸相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明(1)丁草胺染毒30天后，25μg/L和100μg/L劑量可以導(dǎo)致斑馬魚幼魚的生長(zhǎng)因子(CF)增加，但是不同濃度丁草胺處理組中成魚的生長(zhǎng)因子與溶劑對(duì)照組相比，差異不顯著;(2)丁草胺可以提高斑馬魚成魚血漿中和幼魚組織中甲狀腺激素四碘甲狀腺原氨酸(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)水平;(3)丁草胺可以使斑馬魚幼魚促甲狀腺激素釋放

5、激素(CRH)、促甲狀腺激素(TSH)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTR)、甲狀腺激素受體(TRα)、脫碘酶(Deio1)和鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(S1c5a5)等基因的表達(dá)量上調(diào)，葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因(UGT1ab)基因的表達(dá)量下調(diào)，甲狀腺過氧化物酶(TPO)、甲狀腺球蛋白(TG)、脫碘酶(Deio2)和甲狀腺激素受體(TRβ)的表達(dá)量沒有變化。結(jié)果顯示丁草胺對(duì)斑馬魚成魚和幼魚都具有一定的甲狀腺干擾作用。
　　 從下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)調(diào)控

6、角度出發(fā)，研究丁草胺對(duì)斑馬魚成魚產(chǎn)卵及后代的影響;運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測(cè)丁草胺對(duì)斑馬魚成魚血漿中性激素睪酮、雌二醇和卵黃蛋白原水平;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)丁草胺對(duì)斑馬魚幼魚性腺軸的相關(guān)基因表達(dá)的影響，包括雌激素受體(ERα、ERβ1和ERβ2)、卵黃蛋白原（VTGI和VTGⅡ）和芳香化酶(CYP19)等基因。結(jié)果顯示丁草胺對(duì)斑馬魚的性腺軸具有一定的干擾作用，主要表現(xiàn)在(1)丁草胺可以降低斑馬魚雌魚的產(chǎn)卵次數(shù)和產(chǎn)卵

7、量;(2)丁草胺可以降低雄魚的性腺指數(shù)(GSI)，但是對(duì)成魚的肝腺指數(shù)(LSI)沒有影響;(3)丁草胺可以降低斑馬魚雌魚血漿中的睪酮(T)和雌二醇(E2)水平，提高成魚血漿中卵黃蛋白原(VTG)水平;(4)丁草胺可以使斑馬魚幼魚卵黃蛋白原VTGⅡ表達(dá)量上調(diào)，但是對(duì)幼魚雌激素受體（ERα、ERβ1和ERβ2）和芳香化酶CYP19a的表達(dá)量沒有影響。
　　 以雌性成魚為受試對(duì)象，研究丁草胺對(duì)斑馬魚肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響。肝臟是主要