東南景天對鎘的細(xì)胞吸收與積累特征及其與鈣的關(guān)系.pdf

1、我國土壤鎘等重金屬污染問題日趨嚴(yán)重，量大面廣，修復(fù)難度大。植物提取作為一種利用綠色植物轉(zhuǎn)移環(huán)境中污染物的原位修復(fù)技術(shù)，其成本低、環(huán)境友好、不引起二次污染，在污染土壤生態(tài)修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用前景。超積累植物是一類可在地上部高量積累重金屬的特異植物，是應(yīng)用于污染環(huán)境植物修復(fù)的優(yōu)良材料。植物超積累重金屬相關(guān)機制的深入研究，不僅可促進創(chuàng)新植物營養(yǎng)理論的發(fā)展，更有助于為優(yōu)化與改良重金屬污染土壤植物修復(fù)技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。目前國際關(guān)于超積累機理研究進

2、展多集中于十字花科植物，且相較于鎳/鋅等超積累植物，鎘超積累植物種類十分稀少。東南景天（Sedum alfredii Hance）是我國原生的鋅鎘超積累植物，在我國重金屬污染土壤植物修復(fù)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。盡管對東南景天超積累特性和生理機制已有一些研究，但其對鎘的吸收積累機理尚不完全清楚。前期研究表明快速的根系吸收、木質(zhì)部裝載與地上部的區(qū)隔作用是使東南景天超量積累鎘的重要機制，且體內(nèi)鎘的吸收、積累及解毒與鈣的吸收、代謝途徑密切相關(guān)。

3、然而，有關(guān)東南景天地上部如何積累與解毒高量鎘及其與鈣運輸體系之間的關(guān)系尚未探明?；诖耍狙芯恳猿e累生態(tài)型與非超積累生態(tài)型東南景天為材料，在建立與優(yōu)化植物葉片原生質(zhì)體分離與純化技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用熒光探針染色定位、Micro-XRF等技術(shù)，在細(xì)胞水平上較系統(tǒng)地研究了東南景天地上部植物細(xì)胞對鎘的吸收與積累特性及其與鈣運輸體系之間的關(guān)系。研究取得的主要結(jié)果如下:
　　(1)以營養(yǎng)液培養(yǎng)2周的兩種生態(tài)型東南景天為材料，建立并優(yōu)化了植物葉

4、片細(xì)胞原生質(zhì)體與液泡的提取與純化技術(shù)體系。結(jié)果顯示，細(xì)胞裂解液的預(yù)熱處理可加速細(xì)胞壁降解，有效縮短原生質(zhì)體的釋放時間;裂解時間設(shè)置為2h時，兩種生態(tài)型東南景天原生質(zhì)體釋放數(shù)量較多，且不易破碎，而無論縮短或延長裂解時間均不利于原生質(zhì)體的高效提取。經(jīng)上述參數(shù)優(yōu)化后提取并純化后的兩種生態(tài)型東南景天原生質(zhì)體數(shù)量多，質(zhì)量佳。在此基礎(chǔ)上，通過多個參數(shù)比較，改良了原生質(zhì)體裂解液濃度、細(xì)胞保護液濃度以及梯度離心的操作步驟，建立了兩種生態(tài)型東南景天葉片細(xì)

5、胞液泡的提取技術(shù)。本研究建立并優(yōu)化后的東南景天葉片原生質(zhì)體與液泡提取方法具有提取時間短、效率高、操作簡單等優(yōu)點，且獲得的原生質(zhì)體與液泡具有純度高、存活時間長等特點。這一方法體系的建立為進一步從細(xì)胞與亞細(xì)胞層面揭示超積累植物東南景天對重金屬的吸收與積累機制提供技術(shù)支撐。
　　(2)以營養(yǎng)液培養(yǎng)2周的兩種生態(tài)型東南景天葉片為材料，通過上述建立并優(yōu)化的原生質(zhì)體提取技術(shù)分離并純化獲得原生質(zhì)體懸浮液，采用ICP-MS、熒光染色定位等方法研究

6、比較了超積累和非超積累兩種生態(tài)型東南景天葉片細(xì)胞對鎘的吸收特性，及其受低溫、代謝抑制劑與鈣通道抑制劑的影響。結(jié)果顯示，兩種生態(tài)型東南景天葉片原生質(zhì)體對鎘的時間動力學(xué)與濃度動力學(xué)吸收特性并無顯著差異，且吸收量均受低溫抑制。但鎘在兩種類型原生質(zhì)體中的時空分布特征存在明顯差異，經(jīng)200μM鎘處理10min-2.0h后，在超積累生態(tài)型東南景天葉片原生質(zhì)體中可明顯觀察到部分鎘存儲于液泡當(dāng)中，而非超積累生態(tài)型葉片原生質(zhì)中則無此現(xiàn)象。此外，經(jīng)200μ

7、M鎘處理5.0h后，超積累生態(tài)型東南景天葉片原生質(zhì)體仍有部分保持完整，而非超積累生態(tài)型東南景天葉片原生質(zhì)體幾乎全部破裂，且經(jīng)鎘處理不同時間(0.25-7.5 h)后其存活率均顯著低于超積累生態(tài)型(P＜0.05)。此外，鈣離子通道抑制劑對超積累生態(tài)型東南景天原生質(zhì)體鎘吸收有抑制作用，對非超積累生態(tài)型東南景天則無顯著影響，表明前者對鎘的吸收可能由鈣通道調(diào)控。上述結(jié)果表明，兩種生態(tài)型東南景天葉片細(xì)胞原生質(zhì)體對鎘的吸收并無顯著差異，且均是主動需

8、能過程，其主要區(qū)別在于超積累生態(tài)型東南景天葉片細(xì)胞能更迅速地將鎘區(qū)隔到液泡中，這可能在一定程度上減緩了鎘對細(xì)胞的毒害作用。
　　(3)在初步明確“超積累生態(tài)型東南景天葉片細(xì)胞對鎘的吸收可能由鈣通道調(diào)控”的基礎(chǔ)上，進一步采用同步輻射微區(qū)X射線熒光(Micro-XRF)技術(shù)研究了不同外源鈣濃度對超積累生態(tài)型東南景天體內(nèi)鎘在細(xì)胞水平上的分布與積累特性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)不同鈣濃度（0.5mM、2.0mM與8.0mM，分別表示低鈣、正常供

9、鈣與高鈣水平）和100μM Cd處理7d后，低鈣(0.5mM)條件下超積累生態(tài)型東南景天莖葉中的鎘積累量均為最高，隨著鈣濃度增加，葉、莖的鎘積累量明顯下降，其中在幼葉中表現(xiàn)最為明顯。鎘的Micro-XRF分布圖像進一步證實了低鈣處理下葉片中鎘熒光豐度明顯高于正常供鈣或高鈣處理組，且幼葉中鎘主要分布于葉肉細(xì)胞。莖切片中鎘的分布特征顯示低鈣處理條件下其維管組織中鎘的豐度高出正常供鈣或高鈣處理的幾十倍。莖的切片中維管組織進一步精細(xì)掃描結(jié)果表明