中國(guó)柑橘黃龍病病原及分化研究.pdf

1、柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是世界柑橘生產(chǎn)上為害極為嚴(yán)重的一種毀滅性病害，主要分布在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)；黃龍病能侵染各種柑橘類植物，病樹主要表現(xiàn)為斑駁型黃化、均勻型黃化、缺素型黃化和“紅鼻子”果等癥狀，造成植株經(jīng)濟(jì)壽命減短，產(chǎn)量降低，果品質(zhì)劣失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值，從而引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅在2004-2007年，巴西圣保羅州有200萬株病樹被砍除。在我國(guó)的廣東、

2、廣西和福建等地，也有超過4000多萬株柑橘因感染黃龍病被砍除。黃龍病的病原物尚不能人工培養(yǎng)，目前普遍認(rèn)為原核生物薄壁菌門變形菌綱(Proteobacteria)a-變型菌綱(Alphaproteobacteriacea)根瘤菌目(Rhizobiales)根瘤菌科(Rhizobiaceae)韌皮部桿菌屬(Candidatus Liberibacter)是引起黃龍病的主要病原。柑橘黃龍病尚無特效治療性藥劑，也沒有抗(耐)病品種可供應(yīng)用。因此

3、，嚴(yán)格的檢疫措施、使用無病苗木、及時(shí)挖除病樹，以及系統(tǒng)、全面的防治木虱是目前防治黃龍病最有效的方法。為了更好地對(duì)黃龍病病原及其分化進(jìn)行研究，本研究運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)從中國(guó)廣西、廣東、云南、江西、福建、湖南和四川7省的23個(gè)市采集的359個(gè)黃龍病疑似樣品進(jìn)行了黃龍病韌皮部桿菌(Ca.Liberibacter)和植原體的檢測(cè)。比較了斑駁型黃化、“紅鼻子”果、均勻型黃化、缺素型黃化以及無癥狀樣品中黃龍病病原感染情況；同時(shí)，運(yùn)用7種限制性內(nèi)切酶對(duì)

4、黃龍病亞洲種的omp基因進(jìn)行PCR-RFLP和序列分析，以期明確我國(guó)黃龍病病原種類，從而了解亞洲種種內(nèi)分化情況，為黃龍病的起源提供分子依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果：
　　 1、在359個(gè)黃龍病疑似樣品中，237個(gè)樣品檢測(cè)到黃龍病，檢出率為60.02％，且全為黃龍病亞洲種(Ca.Liberibacter asiaticus)此外，有18個(gè)黃龍病疑似樣品感染了植原體，檢出率為5.01％，有7個(gè)樣品混合感染了HLB亞洲種和植原體

5、。
　　 2、結(jié)合癥狀分析，在感染黃龍病亞洲種的237個(gè)柑橘樣品中，表現(xiàn)斑駁癥狀的樣品有173個(gè)(占總數(shù)的73％)；表現(xiàn)“紅鼻子”果的樣品有30個(gè)(占總數(shù)的13％)；表現(xiàn)均勻型黃化的樣品有19個(gè)(占總數(shù)的8％)；表現(xiàn)缺素型黃化癥狀的樣品有10個(gè)(4％)，無癥狀的樣品有5個(gè)(2％)。同時(shí)，在感染植原體的18個(gè)柑橘樣品中，表現(xiàn)均勻型黃化的樣品有11個(gè)(占總數(shù)的61％)；表現(xiàn)缺素型黃化的樣品有7個(gè)(占總數(shù)的39％)；未發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)斑駁型黃

6、化和“紅鼻子”果的柑橘樣品感染了植原體，由此推測(cè)植原體與黃龍病的相關(guān)性不明顯，還有待進(jìn)一步研究。
　　 3、將檢測(cè)到的18個(gè)植原體的16S rDNA通過T-A克隆測(cè)序分析表明，18個(gè)植原體均屬于翠綠黃化組(Ca.Phytoplasma asteri)。
　　 4、對(duì)7個(gè)不同省區(qū)的表現(xiàn)不同癥狀的黃龍病亞洲種進(jìn)行了種內(nèi)分化研究，通過建立的omp基因的擴(kuò)增體系，運(yùn)用TaqⅠ、BclⅠ、ApoⅠ、MssⅠ、SmiⅠ、SspⅠ和E

7、coRⅠ等7種限制性內(nèi)切酶對(duì)omp基因進(jìn)行了PCR-RFLP多態(tài)性分析，結(jié)果表明，上述內(nèi)切酶在黃龍病分離株的omp基因上具有酶切位點(diǎn)，其中，ApoⅠ和TaqⅠ酶產(chǎn)生的多態(tài)性最好。通過RFLP的分析能將23個(gè)分離株區(qū)分成6不同的進(jìn)化組，呈斑駁型黃化的樣品的多態(tài)性最復(fù)雜，而呈黃化型癥狀的樣品多態(tài)性較為單一。
　　 5、通過序列分析表明，本研究的表現(xiàn)不同癥狀、不同品種的23個(gè)黃龍病亞洲種的omp基因與亞洲種Poona株系(AY6421

8、59)和非洲種Nelspruit株系(AY642158)的同源性分別為99.3-99.6％和72.4％-72.7％；同時(shí)，本研究的23個(gè)有代表性的黃龍病樣品的omp基因核酸序列間的最大相似性為99.3％-99.9％。通過進(jìn)化樹分析，所有的亞洲株系都聚在一起，與非洲株系分開；同時(shí)，所有的亞洲株系又分為3個(gè)亞組：HN-ay和GX-nfmj為第一亞組，Indonesian(AB480132)，Vietnamese(AB480111)，Nepa