利用褐菖鲉肝HSPs的LAMP技術快速監(jiān)測海洋石油污染的可行性研究.pdf

1、環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術是一種新穎的核酸擴增技術，該技術以其靈敏度高、特異性強、反應速度快、檢測成本低等優(yōu)點已廣泛應用于各種病原體的檢測，但在環(huán)境污染監(jiān)測方面的應用則較少。
　　 本文以我國海洋經(jīng)濟魚類褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）為研究對象，克隆了四種熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)——HS

2、P60、HSC70、HSP70和HSP90基因序列，分別建立并優(yōu)化定量LAMP技術。為驗證定量LAMP技術的可行性，將褐菖鲉分別暴露于20μg·L-1、60μg·L-1和180μg·L-1原油水溶性成分(water soluble fraction，WSF)，第1、5、10d采樣，利用定量LAMP技術檢測肝HSPs基因的表達情況，并與Real-time PCR結果進行比較。
　　 主要研究結果如下:
　　 (1)建立了H

3、SPs的LAMP檢測方法，并對其中的幾個重要參數(shù)進行了優(yōu)化。結果表明，Mg2+最佳濃度為8 mmol·L-1，外引物與內引物濃度比為1:6時效果最好，最適反應溫度為64℃，最佳反應時間為50 min，甜菜堿最佳濃度為0.4mol·L-1，dNTP最佳濃度為1.4 mmol·L-1。
　　 (2)本實驗以HNB為染料，建立了定量LAMP檢測技術，對其靈敏度進行摸索發(fā)現(xiàn)，檢測限為4.74×104 copies，而Real-time

4、PCR的檢測限為2.75 copies。雖然LAMP的靈敏度低于Real-time PCR，但是LAMP反應快，成本低，耗時短，只需簡易的實驗設備，更適用于現(xiàn)場的快速檢測。
　　 (3)原油WSF短期毒性實驗結果表明，LAMP的檢測結果與Real-time PCR的基本一致，表明該方法可用于實際樣品的快速檢測;不同濃度原油WSF暴露下，不同HSPs基因mRNA的表達變化趨勢不一致，其中對WSF敏感性和特異性較好的是HSP60和H