雞源大腸桿菌ESBLs基因型檢測.pdf

1、大腸桿菌中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的檢出率較高,其比例有逐年上升趨勢,產(chǎn)ESBLs的多數(shù)菌株對青霉素類、第1、2、3代頭孢菌素、喹諾酮類、磺胺類、氨基糖甙類等抗生素呈多重耐藥。ESBLs由普通β-內(nèi)酰胺酶TEM-1、TEM-2和SHV-1經(jīng)個(gè)別氨基酸突變形成,由質(zhì)粒介導(dǎo),易在同種屬甚至不同種屬細(xì)菌間傳遞造成暴發(fā)流行。目前已發(fā)現(xiàn)有400多種,根據(jù)其質(zhì)粒編碼的基因和酶底物的不同,ESBLs基因型有TEM型、SHV型、CTX型、OX

2、A型及其它型共5種,每個(gè)基因型又有很多亞型。細(xì)菌及其所受抗生素選擇壓力不同,其產(chǎn)生ESBLs的基因型、基因亞型亦不同。大腸桿菌中以TEM型和CTX-M型基因?yàn)橹?PER、VEB、GES、BES等少見類型ESBLs也在不斷增加。各個(gè)國家和地區(qū)使用的抗菌藥物不同,流行的ESBLs基因型各不相同。ESBLs的傳播性以及它們的多重耐藥性給臨床抗生素治療造成了極大困難,及時(shí)準(zhǔn)確檢出ESBLs對防止ESBLs流行、控制醫(yī)院內(nèi)感染和指導(dǎo)臨床治療有著非

3、常重要的意義。
　　 2007年5月至2008年12月間,我們用CLSI推薦的ESBLs初篩、確證試驗(yàn)方法、雙紙片協(xié)同法對從河南省各地分離出的35株雞源大腸桿菌進(jìn)行ESBLs檢測,用標(biāo)準(zhǔn)微量兩倍稀釋法及K-B紙片法檢測其對常用抗菌藥物及其聯(lián)合使用的敏感性,并利用分子生物學(xué)方法對雞源大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因的初步分型檢測。
　　 試驗(yàn)結(jié)果表明,35株雞源大腸桿菌中有22株測出產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs),產(chǎn)ESBLs菌株

4、對15種抗菌藥的耐藥率為O～100％,非產(chǎn)ESBLs菌對15種抗菌藥的耐藥率低于產(chǎn)ESBLs菌株,碳青酶烯類藥物亞胺培南和阿米卡星對兩種菌株的敏感率均為100％；而產(chǎn)ESBLs菌株對頭孢類藥物的耐藥率為80％～95％,非產(chǎn)ESBLs菌株對第三代頭孢類藥物耐藥率為23.1％,有著明顯的差異:產(chǎn)ESBLs菌株對多種抗菌藥表現(xiàn)出多重耐藥性和交叉耐藥性；β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑或其它類抗菌藥聯(lián)用均可明顯提高產(chǎn)ESBLs菌對藥物的抗

5、菌活性。
　　 22株產(chǎn)ESBLs菌株用TEM型、SHV型引物經(jīng)PCR擴(kuò)增均擴(kuò)增出861bp的特異性目的片斷；而用CTX型引物經(jīng)PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出905bp的特異性目的片斷；用OXA型引物經(jīng)PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出831bp的特異性目的片斷。四對引物的序列如下:TEM型:上游引物:5'-GGGGATGAGTATTCAACATTTCC-3’,下游引物:5'-GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3'；SHV型:上游引物:5’-

6、GGTTATGCGTTATATTCGCCTGTG-3',下游引物:5'-TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA-3’；CTX-M:上游引物:5'-GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG-3’,下游引物:5'-CGTGCOAGTTCGATTTATTCAAC-3':OXA型:上游引物:5’-TGAAGGGTTGGGCGATTT-3',下游引物:5'-TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA-3’。其中18株大腸桿菌質(zhì)粒上

7、攜帶有TEM片段,但TEM的基因亞型為TEM-1,歸為廣譜β-內(nèi)酰胺酶,SHV型引物未擴(kuò)增出目的片段,9株有CTX片段,6株同時(shí)有TEM和CTX片段,6株有OXA片段,5株同時(shí)有TEM-1和OXA-1,2株同時(shí)有TEM-1、CTX-M和OXA-1.PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序,對序列結(jié)果分析表明,各種TEM型產(chǎn)酶菌的序列同源性為99.9％～100％,與GenBank上的EU979560相比,其中有兩處突變位點(diǎn),但沒有引起氨基酸位點(diǎn)的突變,所以

8、仍屬于TEM-1型廣譜酶。各種CTX型產(chǎn)酶菌的序列同源性為99.2％～100％,產(chǎn)酶菌株ESBLs的基因型分別為CTX-M-14、CTX-M-65、CTX-M-24,已提交的序列1148066與GenBank上已公布的序列EU213262(CTX-M-65)和EF418608(CTX-M-65)的同源性為100％。故為CTX-M-65型。已提交的序列1148088、1148090和1148092與GenBank上已公布的DQ304479