砂梨果實(shí)成熟與軟化相關(guān)基因的克隆、表達(dá)分析及其表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、砂梨（Pyrus pyrifolia Nakai）是我國(guó)的重要果樹之一，在我國(guó)果樹生產(chǎn)中占有重要的地位.該類型的梨果實(shí)不耐貯運(yùn)，貨架期短，極易造成損失。本文以砂梨果實(shí)為試材，利用RACE技術(shù)克隆了ACC合酶、ACC氧化酶、木葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶/水解酶和擴(kuò)展蛋白等與果實(shí)成熟與軟化相關(guān)的酶或蛋白的基因的cDNA全長(zhǎng)，即Ppy-ACS、Ppy-ACO、Ppy-XTH和Ppy-EXPI、Ppy-EXP2、Ppy-EXP3，構(gòu)建了砂梨Ppy-ACs

2、和Ppy-ACO的正義和反義表達(dá)載體，同時(shí)對(duì)所克隆基因在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)情況和成熟果實(shí)中表達(dá)的保守的microRNAs進(jìn)行了芯片分析，主要結(jié)果如下。
　　 1.砂梨ACC合酶基因（Ppy-ACS,EF566865）的cDNA全長(zhǎng)為1，939bp，Ppy-ACS核苷酸序列含有5'-UTR為109bp，1，488bp完整的ORF和3’-UTR為342bp，推導(dǎo)編碼495個(gè)氨基酸。該氨基酸序列具備ACC合酶7個(gè)保守區(qū)和組成該酶活性

3、中心的12個(gè)氨基酸殘基，即SLSKDMGFPGLR。以pYPX145載體為基礎(chǔ)，分別將Ppy-ACS編碼區(qū)序列反向和正向插入相應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建反義和正義表達(dá)載體，命名為pPpy-ACS(-)和pPpy-ACS(+)，目的基因由雙CaMV35S啟動(dòng)子所控制，分別將這2個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105。
　　 2.砂梨ACC氧化酶基因（Ppy-ACO，EF451060）的cDNA全長(zhǎng)1，225bp，Ppy-ACO核苷酸序列有一個(gè)9

4、45bp完整的ORF，5’-UTR為63bp，3’-UTR為217bp，推導(dǎo)編碼314個(gè)氨基酸，該序列具備非血紅素二價(jià)鐵離子依賴型的氧化/加氧酶類的12個(gè)保守氨基酸和催化活性所需的3個(gè)氨基酸。將Ppy-ACO編碼區(qū)序列反向插入pYPX145載體，構(gòu)建了由雙CaMV35S啟動(dòng)子所控制的雙元表達(dá)載體，并成功將表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404.
　　 3.在砂梨果實(shí)發(fā)育期間，Ppy-ACS和Ppy-ACO的表達(dá)量隨果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)

5、育而逐漸地增加，且Ppy-ACO表達(dá)量明顯高于Ppy-ACS;1-MCP明顯抑制果實(shí)采收后12d內(nèi)的Ppy-ACS基因表達(dá)，降低果實(shí)整個(gè)采后期Ppy-ACO的表達(dá)；外源乙烯對(duì)采后果實(shí)Ppy-ACS的表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用，對(duì)Ppy-ACO的表達(dá)亦有明顯的促進(jìn)作用，但在采后末期有所減弱。
　　 4.砂梨木葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶/水解酶基因（Ppy-XTH,EU432411）的cDNA全長(zhǎng)1，248bp，Ppy-XTH核苷酸序列有一個(gè)885

6、bp完整的OEF，5’末端起始密碼子ATG起始于74bp，3’-UTR為290bp，其中含有30bp的Ploy+(A)。Ppy-XTH推導(dǎo)編碼294個(gè)氨基酸，具備XTH蛋白保守的催化活性部位DEIDFEFLG，N-末端具22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，定位于質(zhì)外體。不同物種該家族基因的氨基酸序列聚類分析表明，Ppy-XTH屬于第1類。實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果是Ppy-XTH-果實(shí)膨大前期積累較低，在果實(shí)膨大期大幅增加，在果實(shí)成熟期又

7、顯著下降。
　　 5.砂梨擴(kuò)展蛋白基因Ppy-EXPl(EF602031)、Ppy-EXP2(FJ619347)和Ppy-EXP3(FJ619348)的cDNA全長(zhǎng)分別是1，395bp、1，107bp和1，136bp，分別編碼252個(gè)、251個(gè)和254個(gè)氨基酸，均含有1個(gè)組氨酸(His-Phe-Asp，HFD)功能域。以氨基酸序列為基礎(chǔ)構(gòu)建了12個(gè)物種29個(gè)擴(kuò)展蛋白的分子進(jìn)化樹，Ppy-EXP1和Ppy-EXP2聚為B類，而Pp

8、y-EXP3聚在C類。采用實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR分析了Ppy-EXP1、Ppy-EXP2和Ppy-EXP3在砂梨果實(shí)不同生長(zhǎng)發(fā)育期的表達(dá)情況，Ppy-EXP1和Ppy-EXP2在盛花后0-98d的積累水平很低，在盛花后98d至果實(shí)成熟，其表達(dá)水平略有上升；Ppy-EXP3從盛花期至果實(shí)成熟的表達(dá)量一直處于較高水平，至果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最高水平。
　　 6.以所有物種的6，703個(gè)microRNAs點(diǎn)制的芯片為基礎(chǔ)，對(duì)成熟果實(shí)中表達(dá)的