基于抗生素和重金屬脅迫下的相關(guān)抗性基因的演變過程研究.pdf

1、近年來，由于大量抗生素在人類醫(yī)藥業(yè)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)的濫用導(dǎo)致了大量耐藥細菌的出現(xiàn)，其攜帶的抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)受到人們普遍關(guān)注。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖尤其是魚類養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素和重金屬的使用沒有得到有效監(jiān)管，抗生素、重金屬殘留導(dǎo)致抗生素抗性基因（ARGs）和重金屬抗性基因（HMRGs）廣泛存在于養(yǎng)魚水體中。
　　本論文通過改變抗生素和重金屬組合及分段添加抗生素和重金屬濃度方式，設(shè)計1

2、0個鯽魚養(yǎng)殖的魚缸（30cm×20cm×20cm），選擇3種常見的抗生素（四環(huán)素，磺胺嘧啶，頭孢噻肟鈉）和2種重金屬（Cu，Zn）添加到10個魚缸中，包括5個單獨抗生素和重金屬添加的魚缸（四環(huán)素、磺胺嘧啶、頭孢噻肟鈉、Cu、Zn），4個復(fù)合抗生素-重金屬添加的魚缸（四環(huán)素+磺胺嘧啶+頭孢噻肟鈉、四環(huán)素+磺胺嘧啶、四環(huán)素+磺胺嘧啶+Cu、四環(huán)素+磺胺嘧啶+Zn）以及不添加任何抗生素和重金屬的魚缸作為空白對照，整個實驗周期為180天，包括1

3、2個階段，每15天為一個階段，探究ARGs和HMRGs在抗生素和重金屬選擇壓力下的產(chǎn)生過程。采用PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)，Polymerase Chain Reaction）對21種ARGs和2種HMRGs定性檢測，根據(jù)PCR檢測結(jié)果，對19種ARGs和2種HMRGs進一步采用實時熒光定量PCR進行定量分析，同時測定各個魚缸中3種抗生素和2種重金屬濃度。利用ANOVA（單因素方差分析）分析各個魚缸中目標 ARGs豐度的變化。采用皮爾遜相關(guān)

4、性分析軟件探究環(huán)境脅迫因子與所產(chǎn)生的多種抗性基因之間的相關(guān)性。本研究中的目的基因包括19種ARG（tetA，tetB，tetC，tetD，tetE，tetG，tetM，tetO，tetQ，tetS，tetW，tetX，tetY，sul1，sul2，sul3，blaDHA，blaMOX，blaFOX），2種HMRG（copA，czcA），作為基因標準化衡量指標16S-rRNA以及與基因遷移有關(guān)的指示基因1類整合子基因（intI1）。

5、>　　結(jié)果表明，添加的抗生素和重金屬在水體中的殘留率分別為0.03％-2.46％和9.25％-52.97％，在相同添加濃度下，重金屬殘留率比抗生素高。在整個實驗過程中，tetA，tetC，sul1和sul2在相應(yīng)魚缸中處于主導(dǎo)抗性基因。四環(huán)素類抗性基因比磺胺類抗性基因及AmpC-β內(nèi)酰胺酶類抗性基因?qū)股鼐哂懈叩拿舾卸龋擃惪剐曰蚋菀资芷湎鄳?yīng)抗生素的誘導(dǎo)而產(chǎn)生。雙重和三重抗生素脅迫誘導(dǎo)的魚缸中ARG的總相對豐度是所有單一抗生素脅

6、迫的魚缸中總和的1.01-1.55倍，且三重抗生素比雙重抗生素對ARGs的誘導(dǎo)效應(yīng)更明顯。頭孢噻肟鈉、Zn、Cu的引入對四環(huán)素+磺胺嘧啶體系中ARGs的豐度和多樣性影響結(jié)果表明，頭孢噻肟鈉與四環(huán)素、磺胺嘧啶復(fù)合比Zn和Cu與其復(fù)合產(chǎn)生的四環(huán)素抗性基因豐度和多樣性更顯著。此外，多變量Peason相關(guān)性分析結(jié)果顯示tetA，tetD，tetS和tetX的豐度與頭孢噻肟鈉實測濃度存在顯著相關(guān)性（r=0.912-1.000，p<0.05或p<0