家蠶類COP9信號復(fù)合體蛋白基因的研究.pdf

1、COP9信號復(fù)合體(Constitutiv.Photomorphogeni.signalosom.CSN)是近年來備受關(guān)注的保守蛋白復(fù)合體，含有八個亞單位，其中第五亞基CSN5/JAB1在各物種中保守性最高，且內(nèi)嵌有CSN的功能位點-JAMM基序。CSN以其異構(gòu)酶活性參與蛋白的泛素化降解途徑，調(diào)控細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)及生物體的生長發(fā)育過程。在對本實驗室五齡幼蟲的cDNA庫進(jìn)行檢索中，發(fā)現(xiàn)一條長度為1227bp的基因，預(yù)測其編碼的蛋白有349個氨

2、基酸殘基，相對分子量38 kDa，經(jīng)NCBI比對發(fā)現(xiàn)，預(yù)測編碼的蛋白具有完整的JAB-MPN保守結(jié)構(gòu)域，與COP9信號復(fù)合體具有較高的同源性，將其命名為BmJM。將此基因插入到融合表達(dá)載體pET-28a(+)的多克隆位點，經(jīng)PCR，雙酶切鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta中，IPTG終濃度0 mM-.mM，25-37℃均表達(dá)成功，但表達(dá)的重組蛋白都以包涵體形式存在。經(jīng)過溶解液洗滌，將含有目的蛋白的上清經(jīng)鎳柱親和

3、層析和反相柱層析純化后，以純化的重組蛋白為抗原免疫大白兔獲得該蛋白的多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測，抗體效價可達(dá)1：25600以上。提取家蠶各個時期和組織的天然蛋白和總RNA，利用熒光定量PCR技術(shù)以及熒光Wester.blotting技術(shù)，分析BmJM基因在家蠶發(fā)育過程中不同時期及五齡幼蟲各組織中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)情況。結(jié)果顯示該基因mRNA在家蠶發(fā)育各時期的表達(dá)量由高到低依次為蛾、蛹、幼蟲、卵，說明CSN伴隨著家蠶發(fā)育的完善，作用逐步顯現(xiàn)。