實(shí)驗(yàn)八培養(yǎng)液及用液配制與消毒

1、實(shí)驗(yàn)八 培養(yǎng)液及用液配制與消毒,1、培養(yǎng)液種類（medium）血清（FBS，F(xiàn)CS，CS，HS）合成培養(yǎng)基 如:Eagle MEM、 DMEM、PRMI 1640、Ham F12等無血清培養(yǎng)基（serum free medium）,一、培養(yǎng)液及用液的種類,2、培養(yǎng)用液,1）水與平衡鹽溶液培養(yǎng)用水緩沖溶液生理鹽水平衡鹽溶液（BSS）如：PBS、 Hank’s、D-Hank’s液,2）其他培養(yǎng)用液消化液：胰蛋

2、白酶液、EDTA液抗生素：青鏈霉素pH調(diào)整液：HEPES液、NaHCO3谷氨酰氨液凍存液：用DMSO和培養(yǎng)液配制,二、細(xì)胞培養(yǎng)用液的要求及成分水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g

3、 Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,培養(yǎng)基：,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1）天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富

4、，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,2）合成培養(yǎng)基：,,合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等?！　　　?yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 。 　　　　缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)

5、胞生長(zhǎng)需要。,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）?！　　　⊙逯泻校骸　　　、俣喾N蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） ；　　　　②多種金屬離子；　　　　③激素；　　　?、艽儋N附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等； 　　　?、莞鞣N生長(zhǎng)因子；　　　?、揶D(zhuǎn)移蛋白；　　　　⑦不明成分。,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞

6、不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10％血清．血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ℃ ，30 分鐘。血清的消毒：過濾除菌。,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,消化液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。

7、 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％ 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣

8、譜、穩(wěn)定。,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80％一95％血清 5％一20％碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100單位／毫升,完全培養(yǎng)基的組成,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位／毫升 加三蒸水 至1

9、000ml 過濾除菌，調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清（終濃度 10％）。,三、培養(yǎng)基的配制,細(xì)胞生長(zhǎng)條件,1、濾器準(zhǔn)備,清洗好過濾器，干燥，放入一張孔徑0．22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進(jìn)行高壓滅菌處理。 在超凈臺(tái)內(nèi)打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。 過濾后要檢查濾膜是否完好無損。,2、配制步驟,1．準(zhǔn)備超純水或三蒸水。2．加入合成培養(yǎng)基

10、干粉，用磁力攪拌一定時(shí)間(2—4 h)使之充分溶解。 3．配制RPMll640培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)通入適量C02或加入6 mol／L鹽酸調(diào)pH至6．0左右，這樣才能充分溶解。,,4．加入一定量NaHCO，調(diào)節(jié)pH至7．0左右。 5．加水至最終體積。6．在超凈臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行濾過除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。 7．瓶口封好，4℃冰箱貯存。,四 注意事項(xiàng),1．過濾時(shí)壓力不要太大，以壓力數(shù)字2為宜，否則細(xì)菌