雞柔嫩艾美耳球蟲S07基因免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗的研究.pdf

1、　　本研究將柔嫩艾美耳球蟲SO7基因單獨或與雞白細胞介素2基因融合克隆入pVAX1.0和pcDNA4.0(c)制備免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗，并用構(gòu)建的核酸疫苗免疫動物，評價對E.tenella攻蟲的保護作用。實驗具體分為以下幾個部分： E.tenellaSO7基因的克隆、鑒定及序列分析　　根據(jù)已發(fā)表的SO7基因序列，利用電腦軟件設(shè)計了一對引物，從E.tenella部分孢子化的卵囊中提取總RNA，然后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增出E.te

2、nellaSO7基因并與pMD18-T載體連接，對其進行酶切鑒定、PCR鑒定和測序分析。 E.tenellaSO7基因的原核表達及表達產(chǎn)物純化　　將SO7基因克隆至原核表達載體pET32a(+)中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliBL21，通過IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白。SDS-PAGE電泳顯示，表達的融合蛋白的分子量為40KD左右，且在誘導(dǎo)表達5小時后表達量最多，大約占菌體總蛋白的22.4﹪。細菌經(jīng)超聲波裂解破碎，TritonX-1

3、00洗滌，得到的包涵體被純化，SDS-PAGE電泳顯示，PET32a(+)-SO7表達的重組蛋白大部分存在于包涵體中，上清中含量很少。 免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗的構(gòu)建　　利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建pVAX1.0-SO7、pVAX1.0-SO7-IL2、pcDNA4.0(c)-SO7疫苗，酶切鑒定正確后，將重組質(zhì)粒按100μg/羽雞分別接種14日齡雛雞，7天后取注射部位肌肉、非注射部位肌肉、血液，用RT-PCR和Western-blot

4、ting檢測保護性抗原的轉(zhuǎn)錄與表達情況。 E.tenella免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗的免疫保護性實驗　　用提純的SO7、雞IL2重組蛋白和pVAX1.0-SO7、pVAX1.0-SO7-IL2、pcDNA4.0(c)-SO7重組核酸疫苗，經(jīng)肌肉于14日齡、21日齡兩次注射雛雞，28日齡經(jīng)口接種新鮮的柔嫩艾美耳球蟲卵囊。35日齡撲殺，分別作盲腸病變計分、克盲腸糞便卵囊數(shù)(OPG)、增重、綜合抗球蟲指數(shù)(ACI)幾個指標測定，確定其保護