蘋果腐爛病菌轉(zhuǎn)錄因子VmSom1基因的克隆及功能分析.pdf

1、由Valsa mali引起的腐爛病是危害我國蘋果樹最為嚴(yán)重的生物災(zāi)害。明確病菌的分子致病機(jī)制對有效防控蘋果腐爛病意義重大。本研究在已建立的蘋果腐爛病菌（Valsa mali）ATMT突變體庫的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對蘋果腐爛病菌突變體G1-G50進(jìn)行了表型篩選，得到了致病缺失突變體，并對突變基因進(jìn)行了克隆和序列分析；同時(shí)開展了突變體G23和野生菌株sdau11-175的轉(zhuǎn)錄組測序分析，初步分析了突變基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)和調(diào)控作用。研究結(jié)果如下：

2、
　　1.突變體G1-G5050個(gè)突變體中，僅有G23在生長發(fā)育和致病性方面與野生型菌株sdau11-175有明顯差異。進(jìn)一步對突變體G23的表型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)G23菌株致病性完全喪失，生長速率明顯減慢；與野生型相比，G23氣生菌絲生長較弱，菌落表面較為濕潤；在25℃黑暗條件下培養(yǎng)，突變體G23始終不產(chǎn)生子實(shí)體。
　　2.參照TAIL-PCR、hiTAIL-PCR和FPNI-PCR方法，建立了適合蘋果腐爛病菌pBHt2和 p

3、KO1-HPH兩種載體ATMT突變體的改進(jìn)hiTAIL-PCR方法，該方法較原始的TAIL-PCR方法有著更高的特異性和擴(kuò)增效率，能獲得更長的特異性產(chǎn)物。
　　3.使用改進(jìn)的hiTAIL-PCR方法，克隆得到了突變體G23的T-DNA左右側(cè)翼序列。通過Blast比對分析，確定了T-DNA插入突變基因的位置為蘋果腐爛病菌第12號染色體69537和69547之間，位于一個(gè)編碼假定蛋白的基因VMIG_09677第一個(gè)外顯子內(nèi)。通過突變基

4、因全長克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因與編碼camp-dependent protein kinase pathway protein（Som1）基因同源性最高，因此將其命名為VmSom1。VmSom1基因大小為2723bp，編碼大小824aa的蛋白質(zhì)。通過對VmSom1蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白與MoSom1（Magnaporthe oryzae）和SomA（Aspergillus fumigatus）結(jié)構(gòu)相似，均存在LIM結(jié)構(gòu)域和

5、核定位信號肽。這說明VmSom1蛋白在功能上可能與MoSom1和SomA有著相似性。蛋白同源性分析顯示，在絲狀真菌中，Som1蛋白在同屬真菌內(nèi)存在高度的同源性，但不同屬內(nèi)同源性較低。這說明VmSom1在功能上可能與MoSom1和SomA有著一定的差異性。
　　4.采用Illumina Hiseq2500高通量測序平臺完成了蘋果腐爛病菌sdau11-175和突變體G23的轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得11.75Gb Clean Data。轉(zhuǎn)錄組

6、分析表明，G23相對于sdau11-175，共有差異表達(dá)基因（DEG）857個(gè)，上調(diào)表達(dá)295個(gè)，下調(diào)表達(dá)562個(gè)。對差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO分析、KOG分析和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)大部分差異表達(dá)基因與V.mali的物質(zhì)運(yùn)輸代謝相關(guān)。G23轉(zhuǎn)錄組中共有4個(gè)肌球蛋白和2個(gè)肌動蛋白等11個(gè)細(xì)胞骨架相關(guān)基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，因此VmSom1可能直接或間接調(diào)控胞內(nèi)極性運(yùn)輸。通過比對分析，在G23轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（2個(gè)C2H2鋅指