灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷微生物轉(zhuǎn)化及生物活性研究

1、doi:10.6043j.issn.04380479.201603017灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷微生物轉(zhuǎn)化及生物活性研究灰綠曲霉對(duì)絞股藍(lán)皂苷微生物轉(zhuǎn)化及生物活性研究陳良華1，翁夢(mèng)婷2，秦江2，沈瑞池1，陳清西2，明艷林1（1.福建省亞熱帶植物研究所福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361006；2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361005）摘要摘要：以福建絞股藍(lán)為材料，經(jīng)乙醇溶劑提取和分離獲得絞股藍(lán)皂苷，利用灰綠曲霉微生物轉(zhuǎn)化絞

2、股藍(lán)皂苷，通過(guò)測(cè)定絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抗癌、抗酪氨酸酶和抗氧化活性，比較絞股藍(lán)皂苷經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化修飾后生物活性變化差異結(jié)果表明：灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721有體外抑制作用，半抑制率IC50值為91.66?gmL，而絞股藍(lán)皂苷抗癌效果不強(qiáng)；絞股藍(lán)皂苷對(duì)酪氨酸酶活力具有較強(qiáng)抑制作用，半數(shù)抑制率IC50值為0.14mgmL，而灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抗酪氨酸酶較弱，絞股藍(lán)皂苷對(duì)酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆抑制，其抑制類型為混合型抑制

3、作用；絞股藍(lán)皂苷在0.2mgmL濃度下對(duì)DNA氧化損傷有保護(hù)作用，而灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在2mgmL濃度下顯示保護(hù)作用研究結(jié)果說(shuō)明絞股藍(lán)皂苷微生物修飾后，抗癌作用效果增強(qiáng)，對(duì)酪氨酸酶抑制作用和DNA氧化損傷作用減弱，本研究為利用微生物轉(zhuǎn)化法篩選抗癌絞股藍(lán)皂苷奠定基礎(chǔ)關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞:福建絞股藍(lán)；微生物轉(zhuǎn)化；酪氨酸酶抑制；抗肝癌；抗氧化中圖分類號(hào)中圖分類號(hào):Q356.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A絞股藍(lán)[Gynostemmapentaphyllum

4、(Thunb)Makino]為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)種類繁多，全世界共有14個(gè)種2個(gè)變種，我國(guó)是絞股藍(lán)分布和分化中心[1]2001年國(guó)家林業(yè)局保護(hù)司《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》中，把絞股藍(lán)列入國(guó)家衛(wèi)生部藥食同源保健食品開(kāi)發(fā)原料絞股藍(lán)其化學(xué)成分研究始于上世紀(jì)70年代，目前報(bào)道已分離到主要絞股藍(lán)皂苷(Gypenoside，GYP)已達(dá)到169種之多[2]絞股藍(lán)皂苷結(jié)構(gòu)上與人參皂苷具有類似主骨架的達(dá)瑪烷型結(jié)構(gòu)，屬于四環(huán)三萜皂苷，導(dǎo)致絞股藍(lán)皂

5、苷許多藥理作用與人參皂苷相似，其中主要有抗腫瘤[3]、降血脂血糖[4]、保肝護(hù)肝[5]和防止衰老[6]等藥理作用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾和篩選新先導(dǎo)化合物研究的有效途徑Ko等[7]對(duì)各種糖苷水解酶水解三醇型皂苷混合物進(jìn)行研究，利用來(lái)源于米曲霉(Aspergillisyzae)的半乳糖苷酶和青霉菌(Penicilliumsp.)的乳糖酶粗酶液水解大量三醇型皂苷混合物，分別產(chǎn)生大量的小分子皂苷Rg2和Rh1三萜皂苷衍生物抗腫瘤活性與

6、化學(xué)結(jié)構(gòu)有直接相關(guān)性，構(gòu)效關(guān)系研究表明化學(xué)結(jié)構(gòu)中主要影響因素包括：母核構(gòu)型、側(cè)鏈糖基數(shù)量和位置、羥基收稿日期：收稿日期：20160308錄用日期：錄用日期：20160602基金項(xiàng)目：基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81274149)；廈門市科技創(chuàng)新項(xiàng)目(3502Z20132009)；廈門市對(duì)臺(tái)科技合作項(xiàng)目(3502Z20141041)通信作者：通信作者：xmyanlin@糖20gL，蛋白胨3gL，酵母膏3gL，磷酸氫二鉀8gL，氯化鈣5gL

7、，吐溫802mL，七水硫酸鎂4gL，四水硫酸錳3gL1.2.3絞股藍(lán)皂苷和微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物絞股藍(lán)皂苷和微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC分析分析色譜條件：色譜柱為AgilentEclipseXDBC18（150mm4.6mm）；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm；流速1.0mLmin；分析樣品用0.22nm的濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為20μL；流動(dòng)相為水(A)乙腈（B），梯度洗脫條件為0~8min：A.80%，B.20%；8~20min：A.65%，B.35%；

8、20~35min：A.30%，B.70%；35~40min：A.30%，B.70%；40~50min：B.100%；50~60min：B.100%；60~70min：A.80%，B.20%1.2.4效應(yīng)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的活力測(cè)定及其動(dòng)力學(xué)研究效應(yīng)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的活力測(cè)定及其動(dòng)力學(xué)研究酶的活力測(cè)定及效應(yīng)物對(duì)酶活力抑制作用的研究參考文獻(xiàn)[14]，在3mLpH6.8的測(cè)活體系中（含0.05molL磷酸緩沖液，0.5mmolLLD

9、OPA底物），加入100μLDMSO含不同濃度的絞股藍(lán)效應(yīng)物，加入終濃度為3.33μgmL的蘑菇酪氨酸酶以DMSO為空白對(duì)照，測(cè)定波長(zhǎng)為475nm處的光密度值隨時(shí)間的變化，從直線的斜率求得酶活力，產(chǎn)物消光系數(shù)按ε為3700(molL?cm)1計(jì)算以酶的相對(duì)剩余活力對(duì)樣品濃度作圖，求得效應(yīng)物的IC50值，改變加入的酶量和樣品濃度，得到一組相對(duì)剩余活力隨酶量變化的相關(guān)曲線，判斷效應(yīng)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用機(jī)理，改變底物和樣品濃度，以

10、LineweaverBurk雙倒數(shù)作圖，判斷效應(yīng)物對(duì)酪氨酸酶的抑制類型，求出抑制常數(shù)KI和KIS1.2.5MTT法測(cè)定效應(yīng)物抗肝癌活性法測(cè)定效應(yīng)物抗肝癌活性將不同濃度(06.2512.5255075100?gmL)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物作用于肝癌細(xì)胞72h后，MTT法測(cè)定效應(yīng)物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，按5104mL1的細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔100?L，置CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液；分

11、別加入100?L的對(duì)照組和含效應(yīng)物的給藥組樣品液，每組3個(gè)重復(fù)，共培養(yǎng)72h后吸去培養(yǎng)液；每孔加入200?L0.5mgmLMTT，再孵育4h，吸去上清液，加入200?LDMSO振蕩10min，在酶標(biāo)儀上測(cè)量570nm處吸光度(OD)細(xì)胞抑制率=（OD對(duì)照組－OD給藥組）（OD對(duì)照組－OD空白組）100%1.3.6效應(yīng)物對(duì)效應(yīng)物對(duì)DNA氧化性損傷的保護(hù)作用測(cè)定氧化性損傷的保護(hù)作用測(cè)定在離心管中加入不同濃度的皂苷效應(yīng)物2μL，再依次分別加入

12、0.5μLpBKS載體、3μLPBS（pH7.4，50mmolL）、3μL2mmolLFeSO4，最后再加入4μL30%（體積分?jǐn)?shù)）H2O2然后在37℃下孵育30min，孵育后立即點(diǎn)樣電泳0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠以TAE電泳緩沖液(40mmolLTris20mmolL乙酸鈉，2mmolLEDTA)配制，電泳1.5h，1μgmL溴化吡啶染色30min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照2結(jié)果與分析結(jié)果與分析2.1絞股藍(lán)皂苷和灰綠曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物絞