多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯優(yōu)良降解菌的分離鑒定及降解特性研究.pdf

1、作為持久性有機污染物（Persistent organic pollutants，POPs）的典型代表，多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）和多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）的分析方法、環(huán)境影響及其污染修復(fù)技術(shù)是目前國內(nèi)外熱點研究領(lǐng)域，生物降解特別是微生物降解被認為是去除環(huán)境中PAHs、PCBs的主要途徑。本文在全面綜述國內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，通過

2、調(diào)查和監(jiān)測選擇并確定了PAHs、PCBs污染的土壤樣品，篩選得到的一株可以高效降解PAHs、PCBs的菌株，基于形態(tài)學特征、生理生化試驗、細胞化學成分鑒定及16S rDNA序列比對分析等手段，鑒定該菌株屬于兩面神菌屬（Janibacter sp.），命名為JY11。以此為基礎(chǔ)，系統(tǒng)研究了JY11對PAHs、PCBs的降解效果和影響因素以及與Phanerochaete. chrysosporium JY16聯(lián)合降解效率，并借助氣相色譜--

3、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對降解中間產(chǎn)物的定性分析，初步探討了該菌株對菲、芘、苯并（α）芘和PCB18、PCB77的代謝途徑。論文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.污染土壤中PAHs和變壓器油中PCBs的提取及分析 （1）采用索氏提取、超聲提取及超臨界CO2提取三種樣品前處理技術(shù)，結(jié)合GC-FID分析技術(shù)，研究獲得了濟南煉油廠及勝利油田土壤中PAHs的污染特征。濟南煉油廠土壤中檢出全部16種PAHs，濃度范圍為5.0～593.2μg/kg

4、；勝利油田采油廠土壤中檢出12種PAHs，濃度范圍為227.7～1107.3μg/kg，兩處土壤均在一定程度上受到了PAHs的污染。三種提取技術(shù)均有很好的提取效率和重現(xiàn)性，相對標準偏差（RSD％）小于5％（n=3），PAHs加標回收率為88.7％～102.6％，符合美國EPA標準中環(huán)境樣品回收率（70％-140％）及RSD％（<20％）的要求。 （2）采用液液萃取、超聲萃取及固相萃取等三種樣品前處理技術(shù)，結(jié)合本實驗室前期建立的PC

5、Bs分析方法，研究建立了簡便快速的PCBs提取及GC-ECD分析技術(shù)。研究測定了廢棄國產(chǎn)變壓器油中類二噁英類及阻轉(zhuǎn)類PCBs的成分與含量，檢出10種類二噁英類PCBs（PCB77，81，105，114，118，123，126，156，167，189）和4種阻轉(zhuǎn)類PCBs（PCB45，95，132，149）。實驗還結(jié)合Arcolor1242標準品對變壓器油中PCBs組分進行了分析，得到PCBs的分布特征：二氯聯(lián)苯含量為14.2％；三氯聯(lián)苯

6、含量為51.2％；四氯聯(lián)苯含量為29.8％；五氯和六氯聯(lián)苯含量為4.8％。由此可見，國產(chǎn)變壓器油以三氯聯(lián)苯為主，高氯代PCBs所占比例很少。三種提取方法的RSD％均小于5％（n=3），內(nèi)標PCB209的回收率為82.3％～91.6％，符合美國EPA標準中回收率及相對標準偏差的要求。 2.PAHs、PCBs降解菌的分離與鑒定 （1） PAHs、PCBs優(yōu)勢降解菌的分離。采集濟南市煉油廠、勝利油田采油廠及原濟南市變壓器廠的土樣

7、，以菲、蒽、芘的混合樣品為唯一碳源，采用定時定量轉(zhuǎn)接、逐步提高碳源濃度的方法，共獲得125個單菌落，經(jīng)降解效率初步測定，選取降解能力較強的兩株細菌JY11和JY3A進行鑒定研究。 （2） JY11和JY3A的鑒定。通過形態(tài)特征描述，綜合運用生理生化檢測、脂肪酸分析、甲基萘醌分型及GC摩爾百分含量測定等方法，結(jié)合16S rDNA序列分析、構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，JY3A被認為屬于Bacillus菌屬的B.subtilis類群，由于Bacil

8、lus菌屬目前定名的復(fù)雜性和不確定性，尚需進一步PFGE和DNA-DNA雜交實驗數(shù)據(jù)支持鑒定到種。 （3） JY11被鑒定為Janibacter菌屬。該屬1997年方予以命名，確定模式種為Janibacter limosus，至今僅有5個種的報道。但JY11與該屬模式種有較大差異，與其遺傳距離最近的為Janibacter anophelis。細胞脂肪酸組成及含量分析結(jié)果表明，JY11在脂肪酸化學分類特征上表現(xiàn)出獨特的菌株特異性，不

9、同于Janibacter limosus和Janibacter anophelis的已有報道。初步實驗表明JY11在表現(xiàn)出良好的PAHs降解能力的同時，對PCBs亦有較好的降解能力，因此選擇JY11菌作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。 3.Janibacter sp. JY11對PAHs、PCBs的降解效果及影響因素研究 （1） Janibacter sp. JY11對PAHs的降解效果 研究了液體培養(yǎng)條件下，Janib

10、acter sp. JY11對初始濃度為100 mgl PAHs的降解效果。結(jié)果表明，Janibacter sp. JY11不僅對低分子量PAHs如菲、芴、苊等有很好的降解效果，對四環(huán)的芘、熒蒽、苯并（α）蒽等也有較好的降解效果，五環(huán)和六環(huán)的高分子量PAHs也有不同程度的降解。由此可見，JY11表現(xiàn)出非常寬的降解底物譜及很強的降解能力。 （2）影響Janibacter sp. JYI1對PAHs的降解效率的因素 實驗中分

11、別以三環(huán)的菲、四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并（α）芘為代表，研究了不同PAHs初始濃度、不同濃度的表面活性劑Tween80和Triton X-100及水楊酸誘導作用對PAHs降解效率的影響。結(jié)果表明：隨著初始濃度的增加，芘和苯并（α）芘的降解效率逐漸降低，而菲則可以在很寬的濃度范圍內(nèi)全部降解；表面活性劑Tween80對PAHs降解有一定的促進作用；通過用水楊酸做共代謝底物，相比用菲作共代謝底物，苯并（α）芘的降解效率提高了28％。 （3）

12、Janibacter sp. JY11對PCBs的降解效果 實驗研究了在液相純培養(yǎng)條件下，JY11對初始濃度分別10 mg/l及100 mg/lPCBs的降解效果。結(jié)果表明，隨著初始濃度增加，降解效率略有下降，但總體上JY11對PCBs具有較好的降解效果。對于初始濃度為10 mg/l的PCBs，二氯及三氯PCBs的降解效率為83％～100％，多數(shù)高于90％；四氯PCBs的降解效率為78％～94％；五氯及六氯PCBs的降解效率也

13、達到50～65％。JY11對鄰位、對位取代PCBs均可降解，只是隨著氯原子數(shù)增加，降解效率降低。由此可見，氯原子取代位置并不是影響JY11對PCBs降解的主要因素。 （4）天然植物組分誘導Janibacter sp. JY11降解PCBs 通過在液體培養(yǎng)基中添加九州蟲草子座揮發(fā)油、唐古特青蘭揮發(fā)油、草果揮發(fā)油、香芹酮、檸檬烯等天然植物組分，考察了其對Jannibactor sp. JY11降解PCBs效率的影響。結(jié)果表明

14、九州蟲草子座揮發(fā)油、香芹酮能顯著提高絕大多數(shù)PCBs的降解效率，檸檬稀也有一定的促進作用。 4. Janibacter sp. JY11-P. chrysosporium JY16聯(lián)合降解PAHs、PCBs利用白腐真菌胞外氧化還原酶系豐富，底物專一性低，對外源物質(zhì)的降解不受其濃度大小的影響等優(yōu)點，在Janibacter sp. JY11中加入一株白腐真菌-黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium JY16），研究其聯(lián)合降解

15、作用。實驗結(jié)果表明：液體培養(yǎng)條件下，混合菌對PAHs的降解效果明顯好于單一菌降解效果，尤其是四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并（α）葸、苯并（k）熒蒽的降解效率相比JY11單獨降解提高了20％以上。 5. Janibacter sp. JY11降解PAHs、PCBs中間產(chǎn)物及代謝途徑初步分析 以三環(huán)的菲、四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并（a）芘作為JY11降解PAHs代謝途徑分析的研究對象；以三氯PCB18及類二噁英類PCB77作為JY11降解

16、PCBs代謝途徑分析的研究對象，利用GC-MS技術(shù)，通過對中間產(chǎn)物的檢測，初步推導了JY11降解PAHs、PCBs的代謝途徑。 （1）菲：菲在雙加氧酶的作用下生成順式-2，3-二氫-二羥基菲，然后轉(zhuǎn)化成1-羥基-二萘酸，脫羧后生成1-萘酚，最后開環(huán)生成水楊酸。 （2）芘：芘在雙加氧酶的作用下生成順式-4，5-二氫-二羥基芘，然后在脫氫酶作用下重新芳香化生成順式-4，5-二羥基芘，該產(chǎn)物進一步通過雙加氧酶開環(huán)生成4，5-二羧酸

17、菲，最終在脫羧酶的作用下生成4-羥基菲，最后開環(huán)生成鄰苯二甲酸。 （3）苯并（α）芘：苯并（α）芘在雙加氧酶的作用下生成順式-7，8-二氫-二羥基苯并（α）芘，然后在脫氫酶作用下重新芳香化生成順式7，8-二羥基苯并（α）芘，該產(chǎn)物進一步通過雙加氧酶開環(huán)生成7-羥基-8-羧酸芘。 （4）三氯聯(lián)苯PCB18和四氯聯(lián)苯PCB77代謝途徑基本相同，即JY11進攻PCBs的2，3位，生成2，3-二氫二羥基-PCBs，該產(chǎn)物在脫氫酶的作