酶譜法檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶mmpmmp的活性

1、蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性變化及其臨床意義,綜合性設(shè)計性實驗-2,,此實驗共包括如下三個部分第一部分，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測第二部分，酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性變化及其臨床意義,第一部分，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，也稱空間結(jié)構(gòu)或高級結(jié)構(gòu)，

2、是指蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。高級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能或活性所必須的。X射線晶體學(xué)方法是至今為止研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的方法，所能達(dá)到的精度是任何其他方法所不能比擬的，它的缺點是蛋白質(zhì)的晶體難以培養(yǎng)，晶體結(jié)構(gòu)測定的周期較長。近年發(fā)展起來的多維核磁共振方法可以直接測定蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象，但是由于對樣品的需要量大、純度要求高，被測定的蛋白質(zhì)的分子量一般不超過20000 Da等原因，也受到很大限制。

3、,截至2019年6月，與迅速增長的龐大基因組核酸數(shù)據(jù)相反，已知三級結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)量還不到6萬個。（來自蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)PDB的統(tǒng)計）,利用蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)所提供的氨基酸序列信息來進(jìn)行高級結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法就是應(yīng)這種需要而發(fā)展起來的。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)這一論點，仍然是進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測的理論基礎(chǔ)。目前蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法有： （1）在已知結(jié)構(gòu)（如晶體結(jié)構(gòu)）的基礎(chǔ)上利用分子動力學(xué)方法研究蛋白質(zhì)分子、 核酸分子或復(fù)合物

4、的動態(tài)性質(zhì)。 （2）利用能量優(yōu)化或分子動力學(xué)方法對結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行優(yōu)化；或者是在整體結(jié)構(gòu)已知的情況下建立點突變體的結(jié)構(gòu)。 （3）借助于類似物的結(jié)構(gòu)參數(shù)建立未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 （4）結(jié)合2D-NMR數(shù)據(jù)或X-RAY粗結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)或其他的實驗數(shù)據(jù)建立蛋白質(zhì)的整體模型結(jié)構(gòu)模型。,（5）在上述條件均不符合的情況下，根據(jù)一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，準(zhǔn)確度＜65％。（6）在已知二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行片段堆積，根據(jù)從已知結(jié)構(gòu)得出的一

5、些規(guī)則進(jìn)行篩選，挑選可能的結(jié)構(gòu)，往往得到多種可能性，尚不能得到唯一的正確堆積方式。（7）在單體結(jié)構(gòu)已知的情況下，建立復(fù)合物或多聚體的結(jié)構(gòu)，參考復(fù)合物或聚合物本 身的性質(zhì)，利用幾何匹配和最大接觸面積規(guī)則進(jìn)行。,從待測蛋白質(zhì)序列出發(fā)，搜索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（如PDB,SWISS-PROT等），得到許多相似序列（同源序列），選定其中一個（或幾個）作為待測蛋白質(zhì)序列的模板；待測蛋白質(zhì)序列與選定的模板進(jìn)行再次比對，插入各種可能的空位使兩者的保守

6、位置盡量對齊；建模：調(diào)整待測蛋白序列中主鏈各個原子的位置，產(chǎn)生與模板相同或相似的空間結(jié)構(gòu)，待測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型；利用能量最小化原理，使待測蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)處于能量最小的位置。,同源建模法預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)一般由四步完成：,SWISS-MODEL 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測,SWISS-MODEL利用同源建模的方法實現(xiàn)對一段未知序列的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。該服務(wù)創(chuàng)建于1993年，開創(chuàng)了自動建模的先河，并且它是訖今為止應(yīng)用最廣泛的免費服務(wù)之一。swiss

7、model.expasy.org//SWISS-MODEL.html,,First Approach mode(簡捷模式）這種模式提供一個簡捷的用戶介面：用戶只需要輸入一條氨基酸序列，服務(wù)器就會自動選擇合適的模板。如果一條模板與提交的目標(biāo)序列相似度大于25%，建模程序就會自動開始運(yùn)行，結(jié)果以Email形式返回。,常用觀看蛋白三級結(jié)構(gòu)的軟件,RasMol,WPDB,Cn3D,第二部分，酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9

8、的活性,常見電泳技術(shù),按支持介質(zhì)的不同可分為：紙電泳（Paper electrophorisis）醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate electrophoresis）瓊脂凝膠電泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel-electrophoresis） SDS-聚丙烯酰

9、胺凝膠電泳（SDS-PAGE,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）按支持介質(zhì)形狀不同可它為： 薄層電泳 板電泳 柱電泳,電泳設(shè)備,垂直電泳系統(tǒng),水平電泳系統(tǒng),聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺(N,N ′ -methylene-bisacylamide,簡稱Bis)在加速劑 N,N,N,N-四甲基乙二

10、胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，簡稱AP) 的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。,N,N′-甲叉（亞甲基）雙丙烯酰胺,丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝膠有下列特

11、性：在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；對pH和溫度變化較穩(wěn)定；幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g；凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄

12、膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,SDS－PAGE的原理,聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術(shù)首先是1967年由shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。SDS（Sodiu

13、m Dodecyl Sulfate）是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。因此在電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則

14、主要取決于蛋白質(zhì)分子大小。,不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運(yùn)動示意圖,不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對不同分子量的蛋白質(zhì)混合物分離能力的關(guān)系,腫瘤細(xì)胞的侵襲移動,腫瘤細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞粘附并穿越細(xì)胞外基質(zhì)，包括三個重要的步驟：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細(xì)胞經(jīng)缺口移動。腫瘤細(xì)胞對周圍組織和血管的侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在原灶外存活和增殖，這是癌癥對人類生命的最大威脅。,細(xì)胞間基質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖,細(xì)胞外基質(zhì)(extrac

15、ellular matrix，ECM)主要成份由膠原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖組成。ECM在上皮或內(nèi)皮細(xì)胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存在，在細(xì)胞間結(jié)構(gòu)以間質(zhì)結(jié)締組織(interstitial connective tissue)形式存在。膠原是ECM的主要成分，目前已發(fā)現(xiàn)，至少有12種不同膠原類型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ型膠原是間質(zhì)結(jié)締組織中的主要成分。Ⅳ型膠原則主要存在于基底膜內(nèi)。,腫瘤

16、細(xì)胞的侵襲是需要與細(xì)胞增殖、分化、移動的相關(guān)基因及其表達(dá)調(diào)控模式的改變和促進(jìn)細(xì)胞移動的外界因素兩者的共同作用。雖然腫瘤細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制還不是十分清楚，但已發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子及其信號通路。腫瘤細(xì)胞通過其表面受體與ECM中的各種成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶類來降解基質(zhì)，從而形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)行通道。一般惡性程度高的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的蛋白水解作用，可侵蝕破壞包膜，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。目前較為關(guān)注的酶主要是絲氨酸

17、蛋白酶類，如纖溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金屬蛋白酶(metalproteinase, MMP)類，如膠原酶IV、基質(zhì)降解酶、透明質(zhì)酸酶。,MMPs家族成員根據(jù)其在細(xì)胞中表達(dá)部位的不同，分為胞質(zhì)型和膜型兩大類。前者分布在胞質(zhì)中，后者表達(dá)在膜上。胞質(zhì)型MMPs根據(jù)其作用底物的特異性、敏感性及氨基酸序列的同源性分為三大類： （1）間質(zhì)膠原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-1

18、3，其作用底物主要為間質(zhì)膠原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型膠原, 但不能降解明膠和Ⅳ型膠原； （2）明膠酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型膠原和明膠，還可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型膠原,但不能降解間質(zhì)膠原； （3）間充質(zhì)溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，如纖維粘連蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)，間充質(zhì)溶解素對膠原的作用不同于間質(zhì)膠原酶

19、和明膠酶，它們能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型膠原酶以及Ⅰ型膠原的氨基端。通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。,基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族,MMP-2又叫明膠酶A， 其蛋白主要由纖維結(jié)締組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，分子量為72kDa。MMP-9又稱為明膠酶B，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞多形核白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。分子量為92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。

20、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在細(xì)胞內(nèi)存在形式時發(fā)現(xiàn)的，它能夠與MMP-9聚合形成異源二聚體，保護(hù)和調(diào)節(jié)MMP-9活性，從而促進(jìn)惡變細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。檢測MMP-9和MMP-2的活性，對分析腫瘤細(xì)胞惡性程度和預(yù)后提供幫助。,由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中間的和中間的八段反平行的β折疊

21、所構(gòu)成，這八段反平行式β折疊構(gòu)成了一個β折疊桶結(jié)構(gòu)。此β折疊桶結(jié)構(gòu)一端是開放的，為與配體結(jié)合提供了進(jìn)口；而另一端則被短的N 端310螺旋所封閉。在β折疊桶底部內(nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基，形成了一個疏水核或疏水內(nèi)部，為結(jié)合親脂性配體提供了位點。,NGAL的三級結(jié)構(gòu),MMP-2的結(jié)構(gòu),Pre: 信號肽序列Pro: 帶巰基的前肽Zn: Zn離子結(jié)合部分II: 能結(jié)合膠原的II型纖維結(jié)合素結(jié)構(gòu)域H: 絞鏈區(qū)H

22、emopexin：類血紅素蛋白結(jié)構(gòu)，由四段重復(fù)序列組成，其中第一個與第四個間存在一 個二硫鍵。,MMP-9的結(jié)構(gòu),由三個α螺旋與5個β折疊構(gòu)成含有2個鋅離子和5個鈣離子右圖可見一個小分子化合物位于酶活性中心，并與一個鋅離子結(jié)合,NGAL能與MMP-9以二硫鍵的方式結(jié)合，能起到保護(hù)和調(diào)節(jié)MMP-9功能的作用，所以NGAL與腫瘤的侵襲移動有密切的聯(lián)系。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組以轉(zhuǎn)染有pcDNA3 空白

23、質(zhì)粒載體的SHEEC 細(xì)胞為對照，酶譜法檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染有pcDNA-NGAL (-) 的SHEEC 細(xì)胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明顯降低；而與此同時，轉(zhuǎn)染有pcDNA-NGAL (＋) 的SHEEC 細(xì)胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明顯升高。表明通過有義、反義技術(shù)使NGAL 基因表達(dá)發(fā)生改變可以對SHEEC 細(xì)胞分泌的MMP-9 和MMP-2 的活性產(chǎn)生明顯影響。,M：蛋白marker；1. 細(xì)胞培養(yǎng)基；2.

24、 pcDNA3；3. pcDNA-NGAL ( + )；4. pcDNA-NGAL ( - ),MMP-2和MMP-9活性的強(qiáng)弱與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的能力密切相關(guān)。明膠是這兩種酶的底物。所以在體外通過酶譜法（Zymography）檢測樣品（組織，細(xì)胞培養(yǎng)液，血清，血漿，尿）中MMP-2和MMP-9的活性，對了解腫瘤細(xì)胞的惡性程度、監(jiān)測治療效果和評價預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，

25、含0.1％明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。,實驗原理,實驗操作,樣品制備: 血清、血漿和尿樣品可取適量直接與2×SDS 樣品緩沖液等體積混勻進(jìn)行下一步實驗，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進(jìn)行稀釋;凝膠的制備: 玻璃板對

26、齊后放入夾中垂直卡緊。按表格配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，灌膠時，可用5ml加樣槍吸取凝膠沿玻璃板加進(jìn)去，然后膠上加一層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進(jìn)凝膠聚合（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時凝膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡）。約幾分鐘后當(dāng)異丙醇和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了，再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面表格配4％的濃縮膠，加入TEMED

27、后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出;,在每個加樣孔中加入10 µl樣品;電泳： 在4℃ 100V下，約2h;凝膠的處理： （1）電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫?fù)u動下洗滌1h，其間換液一次； （2）棄去洗滌緩沖液，然后加入

28、孵育緩沖液沒過膠面，至37℃恒溫箱中，24h后取出； （3）棄去孵育緩沖液，加入0.1%考馬斯亮藍(lán)染液染色約30min，回收染液，加入脫色液脫色至藍(lán)色背景和白色條帶均十分明顯時，用5％乙酸中止脫色； （4）待凝膠在5％乙酸中恢復(fù)到適當(dāng)大小后，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶活性。,預(yù)期實驗結(jié)果,第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性變化及其臨床意義,癌癥的發(fā)生發(fā)展

29、是多基因多因素參與的慢性長期過程。癌組織的發(fā)生發(fā)展有著由單純增生→不典型增生→原位癌→浸潤癌演變過程的連續(xù)性。 癌癥分期大別分為四期： 第一期：腫瘤局限一處，沒有擴(kuò)散跡象； 第二期：腫瘤已擴(kuò)散到鄰近的淋巴結(jié)，但沒有波及其它器官或組織； 第三期：腫瘤除了擴(kuò)散到鄰近淋巴結(jié)外，還波及附近器官或組織； 第四期：腫瘤已擴(kuò)散到遠(yuǎn)處的部位；一般言之，第一、二期屬早期，治療后痊愈機(jī)會高；第三、四期屬晚期，治愈及存