強磁場對芽孢桿菌B1偶氮還原酶酶學特性的影響.pdf

1、本文利用一株校園土壤中篩選出具有偶氮染料酸性紅14(Acid Red14-AR14)脫色能力的芽孢桿菌B1(Bacillus sp.，API鑒定)，通過對其偶氮還原酶(Azoreductase-AZR)酶學性質的研究，探討強磁場(High MasticEeld-HMF)對菌株B1的AZR脫色降解AR14特性的影響規(guī)律及其強化機理，實驗主要內容如下： 對照菌株細胞與細胞各部分的AR14脫色實驗，得到胞外粗酶液、細胞膜懸浮液24

2、h始終未顯示出脫色活性，而胞內粗酶液能在3 h內完全脫色、且胞內粗酶液的脫色速率(單位時間內AR14摩爾濃度變化量)是菌株細胞的4.7倍的結果，表明芽孢桿菌B1的AZR定位于細胞質內。菌株B1的最佳產酶接種量為10％時，37℃、120 r/min培養(yǎng)24h；超聲波破碎細胞的最佳條件為：功率250 W、工作10 s、間隙20 s、工作20次，總時間10 min；40～60％硫酸銨沉淀后所得酶為AZR的鹽析純酶。 菌株B1的AZR

3、酶學特性的研究表明：以AR14為底物時，該酶的最適脫色反應溫度和pH值分別為32℃和8.0，在最適區(qū)間之外，AZR的比酶活(每毫克蛋白質的酶活力，U/mg)大幅下降：AZR在40℃以下熱穩(wěn)定性良好，相對比酶活能保持65％以上，但50℃下保溫2 h后相對比酶活僅為2.8％(以32℃的比酶活為100％)；在pH值在5.0～9.0的區(qū)間內，AZR有較高的酸堿穩(wěn)定性。菌株B1的AZR對AR14的脫色活性主要依賴NADH、而不是NADPH作為電子

4、供體；大部分常見的金屬離子都對酶活力表現出一定抑制作用，抑制順序依次為Cu2+、Co2+、Fe3+、Fe2+、Mn2、Na+、Ba2+、Mg2+、K+和Ca2+；濃度為5.0mmol/L、10.0mmol/L和20.0mmol/L的EDTA能抑制部分酶活力；32℃、pH8.0、NADH濃度為1.00mmol/L時，AZR對AR14脫色反應的Km和Vmax值分別為3.99mmol/L和55.07μmol/L·min。 在不同強度

5、(2 T、3 T和4 T的HMF中暴露20 mm)和不同暴露時間(10T的HMF中暴露40、60、240和720 min)的HMF處理后，對菌株的AZR酶學特性進行了考察，結果表明：磁處理菌株胞內粗酶的比酶活隨磁場強度的增加而逐步提高，分別為初始菌株B1的3.69、4.61和4.92倍(2～4 T)，而比酶活則隨處理時間的增加呈現出峰型變化(10 T，40～720 min)，當暴露時間為240 min時，比酶活達到最高值0.092 U/

6、mg：HMF作用并未改變菌株AZR的最適反應溫度和pH(32℃和8.0)，但能有效減緩AZR在最適區(qū)外相對比酶活大幅下降的趨勢(以最適條件下AZR的比酶活為100％)：在相同條件下，4 T較2 T和3 T的HMF更能提高AZR抗EDTA抑制的能力；HMF作用改變了AZR對電子供體的利用能力，不僅使得處理菌株的AZR利用NADH的能力提高了4～8倍，而且使得AZR也具備了利用NADPH為電子供體的能力，同時，不同場強與暴露時間的處理，菌株

7、的AZR利用NADH和NADPH的效率比值呈現一定差異(NADH：NADPH)：1.26、2.73和2.25(2～4T)，3.85、4.24、3.83和3.50(10T，40～720min)：動力學的研究顯示，HMF強化了處理菌株的AZR與染料底物之間的親和能力，Km值由原菌株的3.99 mmol/L下降為1.46 mmol/L、0.90 mmol/L和0.58 mmol/L(2～4 T)。 對HMF強化菌株的AZR的脫色性能