干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)

1、,干細(xì)胞產(chǎn)品技術(shù)服務(wù),,,,OricellTM,OricellTM,,,,最新產(chǎn)品：,1. ES成神經(jīng)元分化試劑盒；2. ES成心肌分化試劑盒；,3. ES成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒；4. MSC成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒；5. NSC成神經(jīng)元分化試劑盒；,6. NSC成星型膠質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒；,目錄：,胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和技術(shù)介紹,成體干細(xì)胞的常見問題與解決方案,1.細(xì)胞和培養(yǎng)（干細(xì)胞、原代細(xì)胞產(chǎn)品和試劑）2.細(xì)胞分化（多個(gè)方向的標(biāo)準(zhǔn)方法

2、）3.細(xì)胞示蹤（GFP/RFP 和定制方法）,干細(xì)胞凍存和復(fù)蘇方案干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù),,,,Stem cell,間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）,Mesenchymal Stem Cells是一種多能干細(xì),胞；,胚胎干細(xì)胞（ES）,Embryonic Stem Cells是一種全能的干細(xì),胞,神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）,Neural Stem cell是一種神經(jīng)系統(tǒng)的多能干,細(xì)胞,,,,Primary cell,神經(jīng)元系統(tǒng)（多個(gè)來(lái)源和物種，海馬、皮層

3、）星型膠質(zhì)細(xì)胞（多個(gè)物種皮層）肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；,肝臟前體細(xì)胞；,分離其他客戶定制細(xì)胞；,,,,胚胎干細(xì)胞,,,,胚胎干細(xì)胞,胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcellES, 細(xì)胞)是指胚泡期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的尚未分化的、能在體外培養(yǎng)、具有發(fā)育全能性的早期胚胎細(xì)胞無(wú)限增殖、自我更新,可分化為三個(gè)胚層來(lái)源的各種組織及細(xì)胞類型,ES細(xì)胞的來(lái)源：5d 胚胎,ABC D,,,,,ES生長(zhǎng)特性,鼠：生長(zhǎng)快，胰酶消化，2天傳一次

4、，可一傳多。,復(fù)蘇率較高。,人：生長(zhǎng)慢，機(jī)械分離，7~10天傳一次，相,對(duì)較少。1:4~1:6。,復(fù)蘇率低。,,,,,,,表面抗原的表達(dá),Oct-4：一種轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)育全能性的標(biāo)志。,堿性磷酸酶（AKP）：常被用來(lái)作為鑒定ES,細(xì)胞及其分化與否的重要標(biāo)志。,SSEA-1：小鼠ES表達(dá),SSEA-3、SSEA-4：人ES表達(dá),,,,染色體結(jié)構(gòu),核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。,46，XX；46，XY,,,核型檢測(cè)：

5、46，XX,多能性和全能性體內(nèi)：畸胎瘤實(shí)驗(yàn)特定抗,擬胚體,特定條件誘 體免疫導(dǎo)/自然分化 組化,體外分化,去除飼養(yǎng)層細(xì)胞,,,,,全能性,體內(nèi)：畸胎瘤實(shí)驗(yàn),體外：去除飼養(yǎng)層細(xì)胞,擬胚體（EB, embryoid body。為ES 細(xì)胞懸浮,生長(zhǎng)自發(fā)分化形成,含有內(nèi)中外三個(gè)胚層組織,能基本上模擬體內(nèi)的發(fā)育過程) ；貼壁誘導(dǎo)；,特定條件誘導(dǎo)/自然分化（除去LIF）各胚層特定抗體免疫組化

6、檢測(cè),體內(nèi)：畸胎瘤檢測(cè),血管組織呼吸道上皮,鱗狀上皮,腺體組織脂肪組織,,,,體內(nèi)分化,外胚層：鱗狀上皮、神經(jīng)組織等,中胚層：骨和軟骨、橫紋肌、骨骼肌、血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等內(nèi)胚層：柱狀上皮、腸管樣組織等,,,,體外：分化形態(tài),ES貼壁誘導(dǎo),EB約5~7天后出現(xiàn)自主性搏動(dòng),,129 Mouse,Human ES,,,,免疫組化

7、檢測(cè),Nestin (ectoderm )Troponin (mesoderm ),Tubulin (ectoderm )AFP (endoderm),,,,神經(jīng)分化：貼壁誘導(dǎo)第2天,神經(jīng)分化：貼壁誘導(dǎo)第5天,,,,IHC β‐3 Tublin,特異性抗原的表達(dá)情況,抗原人ES鼠ES,Oct-4++,Nano

8、g++,SSEA-1ˉ+,SSEA-3+ˉ,SSEA-4+ˉ,不斷有新的蛋白標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)和論證,,,,堿性磷酸酶染色,,,,小鼠ES流式圖,,,,染色體結(jié)構(gòu),核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。,人（46，XX），鼠（40，XY),,,,性別分析,性別通過PCR的方法鑒定，目的基因是基因組,DNA的Y染色體相關(guān)基因Tspy，陽(yáng)性對(duì)照用X,染色體相關(guān)基因PolA1以及G

9、apdh 。,,ES Clone,mES-GFP,HumanES-GFP,,,,MEF 細(xì)胞：ES成功的一個(gè)重要因素,Cyagen提供的MEF經(jīng)過γ-irradiation 處理，,確保所有的細(xì)胞都完全失去增殖能力，又可以保證最佳支持和分泌能力，同時(shí)沒有任何化學(xué)有毒物質(zhì)的污染，為你ES細(xì)胞提供最佳的生長(zhǎng)環(huán)境；為ES的增殖提供多種因子；,,,,實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查普遍結(jié)果：,據(jù)Cyagen 對(duì)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用的53個(gè)ES細(xì)胞,的樣品進(jìn)行檢

10、測(cè)，45%被支原體污染；,沒有嚴(yán)格質(zhì)量控制和環(huán)境控制的情況下制作的,MEF：有35%以上是攜帶支原體，這個(gè)數(shù)據(jù),還根據(jù)操作技術(shù)不成熟，使用動(dòng)物污染嚴(yán)重情況，風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)大大的增加；,,,,絲裂霉素‐C（MITOMYCIN C）：,A、長(zhǎng)期接觸絲裂霉素‐C，藥物毒性將嚴(yán)重影響操作人員的身體健康；（單位量10‐30ug/ml處理20個(gè)10cm dish需要3‐6mg）,B、絲裂霉素‐C溶液的不穩(wěn)定，4℃保存，也會(huì)快速降

11、解，導(dǎo)致處理的細(xì)胞不能完全失活，這將嚴(yán)重影響后面實(shí)驗(yàn)分析；,C、絲裂霉素‐C的殘留，微量的絲裂霉素‐C也會(huì)造成ES細(xì)胞增殖抑制和分化；（因?yàn)槠涫羌?xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合劑）,,,,,OCT-4 (+)SSEA-1 (-)SSEA-4 (+),AAA,BBB,C

12、CC,,,,Es細(xì)胞培養(yǎng)的過程：,如何準(zhǔn)備狀態(tài)良好的MEF細(xì)胞；消化傳代過程；,如何去除MEF細(xì)胞；挑克隆的操作；,如何準(zhǔn)備用于進(jìn)行各種基因操作的細(xì)胞；如何準(zhǔn)備用于進(jìn)行注射的細(xì)胞；,,,,如何準(zhǔn)備狀態(tài)良好的MEF細(xì)胞；,取胚胎（13.5d）：去除頭部和四肢；,剪碎后加入0.125%胰酶進(jìn)行消化到組織塊基本消失；,終止消化并離心收集細(xì)胞；（檢測(cè)細(xì)胞支原體）重懸接種：5000-10000c

13、ells/cm2第二天換液后培養(yǎng)3天，進(jìn)行γ-射線照射；凍存檢測(cè)；,,,,生產(chǎn)過程控制：,動(dòng)物：胚胎的孕齡；動(dòng)物的污染物；細(xì)胞的支原體；,細(xì)胞的支持能力；細(xì)胞的失活；,蛋白表達(dá)檢測(cè)；,,,,合適的MEF的密度：,細(xì)胞的貼壁效率；細(xì)胞的分泌能力；細(xì)胞的大??；,,,,最佳的密度受到很多因素影響：25000cells,過密：克隆生長(zhǎng)緩慢，克隆小，但是立體感好；過?。嚎寺∪菀追只?，邊緣不清晰，但是克隆增殖稍快；

14、,最佳的密度：克隆邊緣清晰，細(xì)胞容易增殖，大小均一。,,,,如何去除MEF：,無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)：但是代數(shù)非常有限，基本不能長(zhǎng)期傳代；,MEF培養(yǎng)：可以長(zhǎng)期培養(yǎng)，細(xì)胞的狀態(tài)好，不,影響細(xì)胞的全能性；,原理：利用不同細(xì)胞的貼壁的時(shí)間差異；,步驟：消化后離心重懸，在包被明膠的皿上貼壁,30min，輕輕吸出上清，接入另外一個(gè)包被有,明膠的皿中30min，再吸出上清中的細(xì)胞；并在包被的皿上培養(yǎng)一段時(shí)間，就可以去除大部分的MEF細(xì)胞；,,,,影

15、響因素：,克隆的狀態(tài)：分化的細(xì)胞的貼壁性會(huì)大大增加；,MEF的狀態(tài)：MEF如果有大量的碎片也會(huì)增加,液體的粘稠度干擾細(xì)胞的正常分離；,消化的效果：如果有MEF沒有和ES很好的分開，會(huì)將ES一起貼在皿上；,細(xì)胞團(tuán)和顆粒：顆粒大細(xì)胞團(tuán)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞快速沉淀并導(dǎo)致細(xì)胞貼壁；,如果效果不佳可以進(jìn)行多次的重復(fù)，但是會(huì)大大減少細(xì)胞的回收率；,,,,ES細(xì)胞的傳代：,細(xì)胞的克隆出現(xiàn)足夠大，細(xì)胞的邊緣開始出現(xiàn)不清晰，細(xì)胞的克隆出現(xiàn)部分分化的情況；一

16、般的周期是3-5天；,傳代比例依據(jù)細(xì)胞的克隆大小和細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，比例為1：5-1：10；,消化的時(shí)候觀察一般以MEF為標(biāo)準(zhǔn)，如果MEF基本上已經(jīng)開始脫壁就可以終止消化；,,,,?,?,?,?,?,挑克隆技術(shù)：,當(dāng)克隆大部分出現(xiàn)分化的時(shí)候；克隆大小不均并且生長(zhǎng)緩慢；注意事項(xiàng)：,拉針（要注意末端的大?。┗蚴褂?ml的注射器；,在體視鏡下操作，要在解剖超凈臺(tái)中操作；注意環(huán)境，避免污染；,提取的克隆要消化后才能進(jìn)行接種；

17、單克隆的培養(yǎng)周期長(zhǎng)，要更有耐心；,,,,用于ES囊胚注射的細(xì)胞控制：,低代數(shù)：（細(xì)胞的全能型和基因變異和染色體變異）,低分化程度：（細(xì)胞分化會(huì)大大影響細(xì)胞最后的整合的效率和生殖遺傳的比例）,最低的控制標(biāo)準(zhǔn)：正常的核型，細(xì)胞的各種分化蛋白沒有表達(dá)，各種ES的正常表達(dá)蛋白正常；具有成瘤性；增殖速度快；無(wú)任何外源污染；,,,,其他類型的成體干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞,,,,,,間質(zhì)干細(xì)胞是目前研究最多的干細(xì)胞,來(lái)源研究方向：

18、不斷有文章報(bào)道從不同的組織分離出MSC，整體方向是有利臨床廣泛取材和減少病人痛苦；,與組織工程結(jié)合的研究方式，最重要是如何提高與組織的相容性和提高在向多個(gè)方向分化的控制，如何成為一個(gè)真正的組織；,臨床治療研究，也是目前細(xì)胞治療的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)主要的治療細(xì)胞；,基因研究的載體，干細(xì)胞分化機(jī)制模型；,,,,Cyagen能夠提供協(xié)助：,來(lái)源研究：基本上從體內(nèi)的各個(gè)組織中發(fā)現(xiàn)非常多的干細(xì)胞，包括肌肉，肺部，肌腱，血管，皮膚等，而這

19、些細(xì)胞都具有含量非常少，同時(shí)也具有非常明顯的組織特意性，表達(dá)非常多的組織特異性的蛋白；（提供高難度提取服務(wù)）,組織材料學(xué)：結(jié)合納米材料和其他生物學(xué)材料，用于研究具有臨床前景的材料；（細(xì)胞相容性，蛋白表達(dá)，細(xì)胞分化分析等）,臨床研究：如何從單一來(lái)源獲得大量穩(wěn)定而且維持良好的生物學(xué)特性的細(xì)胞，同時(shí)保證生物的安全性；（提高全套的技術(shù)支持和服務(wù)）,,,,間質(zhì)干細(xì)胞,定義：來(lái)源于中胚層的早期細(xì)胞， 能夠分化為多種中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)

20、源的細(xì)胞。,來(lái)源組織：骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。來(lái)源物種：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。,,,,分離方法,骨髓,人，猴子，犬,密度梯度離心法：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。,大鼠，小鼠，兔子：全骨髓貼壁法,脂肪等組織：,人、大鼠、小鼠： 酶消化法,,,,,,,鑒定方法不同物種的表面標(biāo)記差異：,表面標(biāo)志人 ,猴子

21、大鼠小鼠,陽(yáng)性CD29,CD44,CD71,CD90CD29,CD44,CD105CD29,CD44 ，CD166,陰性CD34,CD45,CD105,CD166CD34,CD45弱陽(yáng):CD34，CD45,,,,傳代能力,有限增殖，隨著傳代次數(shù)增加，分化能力逐漸降低，按照1：2的比例：,人：1~2代達(dá)到純化，最多15~20代。,大鼠：3~4代達(dá)到純化，最多20~25代。,小鼠：

22、7~8代達(dá)到純化，最多25~30代。,,,,間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的問題/解決方案,? BMSCs：來(lái)源長(zhǎng)骨的骨髓，體內(nèi)與造血功能有緊密關(guān)系，,但是也存在牙髓和其他短骨里面，缺點(diǎn)是取材時(shí)給病人的痛苦較多；,? ADSCs：來(lái)源全身的脂肪組織，包括皮下和內(nèi)臟脂肪墊；,來(lái)源屬于微創(chuàng)方法取材，主要是來(lái)源于抽脂減肥的手術(shù)；,? 其他來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞：胰腺干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、肌腱干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞等；還有新生兒的臍帶、胎盤

23、等其他組織；,,,,? 細(xì)胞形態(tài)：不同的組織來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)多樣，,基本無(wú)法從細(xì)胞的形態(tài)上進(jìn)行有效的區(qū)分；,? 表面抗原：不同來(lái)源的細(xì)胞的表面標(biāo)記會(huì)有差異BMSC和ADSCs的區(qū)別就是CD106（+/-）和CD49d（-,/+）；,? 分化能力：會(huì)有較大的波動(dòng)，隨著不同個(gè)體、不同組織,來(lái)源會(huì)有變化；,? 培養(yǎng)液選擇：不同來(lái)源也是不同！,,,,,間質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)特征,P0,40X,P3,40X,,,,骨髓間質(zhì)干細(xì)胞定向分化

24、為脂肪細(xì)胞,,,,,梭形、纖維樣細(xì)胞原代：克隆樣生長(zhǎng)傳代后：勻質(zhì)、渦旋狀排列,HumanDog,RatMonkey,MouseRabbit,,,,間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),標(biāo)準(zhǔn)：,1.增殖速度變化；2.細(xì)胞分化影響；3.形態(tài)學(xué)變化；,4.克隆形成率變化；5.基因表達(dá)影響；,6.使用的特殊要求；7.價(jià)格因素；,,,,如何選擇間質(zhì)干細(xì)

25、胞培養(yǎng)系統(tǒng)？,? 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇:依據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)和要求參照文,章進(jìn)行優(yōu)化，需要添加部分的氨基酸或者糖；,? 血清篩選：應(yīng)該利用10株以上的細(xì)胞，進(jìn)行克隆,形成率、生長(zhǎng)曲線、分化能力的比較；,? 添加物：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、抗生素、細(xì)胞,因子添加；,優(yōu)選專業(yè)血清,普通胎牛血清,普通牛血,清,,,,,,細(xì)胞培養(yǎng)過程常見問題,細(xì)胞增殖速度下降：間質(zhì)干細(xì)胞不是無(wú)限的細(xì)胞系，最佳的實(shí)驗(yàn)窗口是P3-P8；,細(xì)胞老化：培養(yǎng)環(huán)境不

26、適合（包括培養(yǎng)的表面和培養(yǎng)液）；胰酶對(duì)細(xì)胞表面蛋白的傷害；缺乏相關(guān)的生長(zhǎng)因子；細(xì)胞本身端粒影響；,細(xì)胞分化：血清中激素影響、培養(yǎng)表面影響、體外培養(yǎng)時(shí)間影響；,,,,間質(zhì)干細(xì)胞常見的污染和控制,細(xì)胞污染、造血系統(tǒng)細(xì)胞；,取材來(lái)源污染：病毒、或者其他感染；,支原體污染：隱性污染，一般難以察覺，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不斷下降，影響細(xì)胞正常增殖，擴(kuò)散和污染環(huán)境，影響最大；,,,,神經(jīng)干細(xì)胞,廣泛存在于成年或胚胎哺乳動(dòng)物大腦內(nèi),可分化為神經(jīng)元、星

27、形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。,,,,神經(jīng)干細(xì)胞,,,,神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性,Nestin陽(yáng)性,自動(dòng)聚集成球，球體的表面存在絨毛懸浮生長(zhǎng),無(wú)血清培養(yǎng)，血清替代物，bFGF，EGF,,,,神經(jīng)干細(xì)胞,,,,NSC存在神經(jīng)系統(tǒng)中的干細(xì)胞,分化：神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等,,,,NSC取材和培養(yǎng),鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）：來(lái)源于14.5d胚胎的大腦GE區(qū)；,,,大鼠神經(jīng)干細(xì)胞-懸浮培養(yǎng)

28、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng),大鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng),,,,使用Cyagen 神經(jīng)干分化試劑,使用血清誘導(dǎo),,,,NSC的操作要點(diǎn)：,傳代培養(yǎng)：,1、懸浮培養(yǎng)必須控制球的大小，傳代時(shí),自然沉降，去除其中大球；可以使用機(jī)械的方法；,2、懸浮法培養(yǎng)可以獲得大量的細(xì)胞；,3、貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞可以用于轉(zhuǎn)基因操作，,但是費(fèi)用很高；,4、整個(gè)培養(yǎng)過程必須保證無(wú)血清；5、保

29、證細(xì)胞純度，獲得高擴(kuò)增率；,,,,干細(xì)胞的分化機(jī)理和相關(guān)的技術(shù)產(chǎn)品,,,,干細(xì)胞分化機(jī)理,Wildtype,mouse,fibroblasts,Mouse,Fibroblasts,Carrying,Myf5 BAC,,,,干細(xì)胞分化能力鑒定,分化試劑（檢測(cè)干細(xì)胞的尺）：必須穩(wěn)定，否則結(jié),果波動(dòng)非常大，將無(wú)法分析；,每次配置的分化試劑：必須是有陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，保證有分化誘導(dǎo)能力再用于檢測(cè)其他的細(xì)胞；不同的物種間最佳的誘導(dǎo)物濃度不同

30、，所以不同物種間最好做一下濃度上面的優(yōu)化；,,,,,,,,,,干細(xì)胞分化的常見問題,分化比例影響因素；,? 細(xì)胞群分化能力：整個(gè)細(xì)胞群體中干細(xì)胞的比率決定；? 代數(shù)：細(xì)胞的分化比率隨代數(shù)增加下降；,? 誘導(dǎo)系統(tǒng)穩(wěn)定性：誘導(dǎo)組方、藥物效價(jià)和配置過程影響；,,,,,,,分化時(shí)間影響因素,成骨：2-4周成脂：2-4周,成軟骨：3-4周,不同物種：人和大鼠容易誘導(dǎo)，小鼠的需要更長(zhǎng)時(shí)間，狗和兔子誘導(dǎo)時(shí)間波動(dòng)大；,動(dòng)物大小影響：人和

31、靈長(zhǎng)類、狗等胚胎期或者新生代幼體分化率偏低；而成體的來(lái)源的MSC分化能力高！,臍帶、臍血的MSC分化比例較低。,細(xì)胞質(zhì)量影響才是影響分化關(guān)鍵的核心！,,,,分化的影響因素,不同的物種：波動(dòng)很大，不能橫向比較；,不同提取方法：操作方法的差異，導(dǎo)致細(xì)胞群組成差異；,不同的培養(yǎng)系統(tǒng)：影響細(xì)胞的形態(tài)、大小、克隆的形態(tài)也不同，分化能力也有差異；使用a-,MEM會(huì)降低干細(xì)胞的成脂肪分化；,不同代數(shù)：分化也是會(huì)有波動(dòng)，同時(shí)各個(gè)方向的分化變化

32、的速度不同步；,,,,Cyagen提供完善的分化系統(tǒng),骨、脂肪、軟骨分化：囊括了多個(gè)物種、多種來(lái)源的干細(xì)胞的分化的試劑；穩(wěn)定高效：干細(xì)胞的金指標(biāo)；心肌分化、神經(jīng)分化,OricellTM提供定制的分化服務(wù)；,,,,干細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)解決方案,應(yīng)用的方向；,? 大動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：包括靈長(zhǎng)類 等，需要的細(xì)胞量都是,108這個(gè)數(shù)量級(jí)以上；,? 多組動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)：要獲得更加有說(shuō)服力結(jié)果；? 大規(guī)模的篩選：中藥成分篩選、藥物單體實(shí)驗(yàn)；

33、? 臨床使用干細(xì)胞：干細(xì)胞的最終應(yīng)用；,OricellTM 提供大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)服務(wù),,,,OricellTM大規(guī)模培養(yǎng)的實(shí)現(xiàn),使用T175培養(yǎng)：數(shù)量上可以直接增加，但是增加污染的風(fēng)險(xiǎn)，系統(tǒng)不穩(wěn)定；,使用多層培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶；,使用小型細(xì)胞培養(yǎng)罐：細(xì)胞擴(kuò)增容易但是收獲困難，條件控制不成,熟；,密閉的細(xì)胞工廠系統(tǒng)：全密閉系統(tǒng)，可以用增加數(shù)量方法放大規(guī)模，但是成本較高，需要環(huán)境控制系統(tǒng)；,,,,,?,?,?,?,干細(xì)胞質(zhì)量控制和解決方

34、案；,表面標(biāo)記與細(xì)胞分化：,表面標(biāo)記有哪些核心標(biāo)記：現(xiàn)在目前并未有一個(gè)非常特異得到公認(rèn)的表面抗原分子；,Cyagen研究發(fā)現(xiàn)，表面抗原分子和分化不具有,穩(wěn)定相關(guān)性；,表面抗原變化主要集中在前期和高代數(shù)時(shí)變化；分化能力的變化主要和代數(shù)有關(guān)，和表面標(biāo)記有半相關(guān)性；,,,干細(xì)胞增殖能力指標(biāo)；,? 生長(zhǎng)曲線：表現(xiàn)細(xì)胞自我更新能力的一個(gè)指標(biāo)；? 克隆形成率：表示具有較強(qiáng)自我更新能力的細(xì)胞,的比例的指標(biāo)；,屬于和干細(xì)胞“Self-R

35、enew”相關(guān)；,,,,?,?,?,?,?,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞污染物控制,細(xì)胞污染物的控制和檢測(cè)方法；,細(xì)胞間污染：不能不同細(xì)胞一起操作，使用相同的一瓶試劑；操作最好間隔1個(gè)小時(shí)；,細(xì)菌污染：所有使用的培養(yǎng)試劑進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)；,真菌污染：嚴(yán)重影響細(xì)胞體內(nèi)試驗(yàn)，一旦出現(xiàn)極難處理；內(nèi)毒素：對(duì)所有使用的器械、容器、管道都進(jìn)行處理，,250度干烤或者是用堿洗；,外源異物污染：避免使用玻璃操作，使用有認(rèn)證的產(chǎn)品，個(gè)人防護(hù)；同時(shí)使用前對(duì)細(xì)胞懸液

36、中進(jìn)行觀察，看是否有顆粒；,,,,大規(guī)模和有穩(wěn)定質(zhì)量控制的細(xì)胞的應(yīng)用,動(dòng)物的體內(nèi)試驗(yàn)和解決方案,,,,干細(xì)胞的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),,,,?,?,?,?,干細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用的注意事項(xiàng),凍存的細(xì)胞是否可以復(fù)蘇直接用于實(shí)驗(yàn)；理論上是可行，但是對(duì)凍存液要求很高；復(fù)蘇率達(dá)到90%以上，減低死亡細(xì)胞影響；,MSC類的細(xì)胞普通凍存液復(fù)蘇后細(xì)胞非常的脆,弱，最好經(jīng)過一次的培養(yǎng)；,需要清洗：去血清和DMSO（2.5-11g/kg），同時(shí)降低內(nèi)毒素；,O

37、ricell TM NCR凍存液、DMSO-Free凍存液,,,,細(xì)胞自然成團(tuán)對(duì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的影響,導(dǎo)致血管內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞栓塞，直接導(dǎo)致動(dòng)物急性死亡；,會(huì)在肺部、肝積聚，減低器臟功能，長(zhǎng)期會(huì)有纖維化風(fēng)險(xiǎn)；,細(xì)胞在懸浮的狀態(tài)下，會(huì)自然的聚集成松散團(tuán)；死細(xì)胞多，釋放的DNA會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚成大團(tuán)；,1. 一小時(shí)內(nèi)使用：,2. 細(xì)胞充分吹勻或者使用濾網(wǎng)：200-250目3. 培養(yǎng)過程中細(xì)胞絕對(duì)不能過密：80%最佳4. 細(xì)胞代數(shù)不能太高<

38、P5,,,,體內(nèi)試驗(yàn)的實(shí)現(xiàn)方法：,注射的方法和溶劑；,局部注射：肌肉、肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)；全身注射：鼠尾靜脈、兔子耳緣靜脈等；溶劑：培養(yǎng)液、PBS、HBSS、生理鹽水；污染物的控制；（內(nèi)毒素、熱源、真菌污染、外源物質(zhì)污染的影響）,,,,體內(nèi)研究：示蹤作用,GFP/RFP干細(xì)胞研究中重要作用,干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的生物學(xué)變化（如遷移、分布、增殖、分化等）都離不開對(duì)植入干細(xì)胞的示蹤和定量技術(shù)。,GFP或RFP由于檢測(cè)方便、表

39、達(dá)穩(wěn)定和不影響細(xì),胞功能等特點(diǎn)，目前在干細(xì)胞的移植研究中GFP或RFP的重要性越來(lái)越得到重視。,,,,GFP、RFP標(biāo)記,綠色熒光蛋白（GFP）紅色熒光蛋白（RFP）,擬人化綠色熒光蛋白（hrGFP）,,,,GFP、RFP標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),檢測(cè)方便：不需要底物或輔因子,可對(duì)活體檢測(cè),因而可對(duì)被標(biāo)記對(duì)象進(jìn)行動(dòng)態(tài)、連續(xù)的觀察。熒光穩(wěn)定，不易淬滅，尤其是hrGFP對(duì)細(xì)胞的毒性較小,,GFP標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞,,GFP/RFP

40、標(biāo)記的小鼠胚胎干細(xì)胞,,,,GFP標(biāo)記的間質(zhì)干細(xì)胞,成人間質(zhì)干細(xì)胞,胎兒間質(zhì)干細(xì)胞食蟹猴間質(zhì)干細(xì)胞,,,F344大鼠間質(zhì)干細(xì)胞,SD大鼠間質(zhì)干細(xì)胞,Wistar大鼠間質(zhì)干細(xì)胞,,,,神經(jīng)干細(xì)胞,人神經(jīng)干細(xì)胞,小鼠神經(jīng)干細(xì)胞,GFP標(biāo)記的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞,,干細(xì)胞應(yīng)用研究,賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司,,,,干細(xì)胞研究為什么引起這么大的重視,肌萎縮側(cè)索硬化病 (ALS),Alzheimer’s Dis

41、ease,,,,造血干細(xì)胞移植,我國(guó)白血病的年發(fā)病率為4/10萬(wàn)人，每年新增約4萬(wàn)名白血病患者, 其中約2萬(wàn)名是兒童。我國(guó)長(zhǎng)江流域以南的兩廣和云貴地區(qū)的地中海貧血的發(fā)病率高達(dá)10%以上,廣東省每年新增重度,beta-地貧患兒400名。,一些重度自身免疫性疾病,如紅斑狼瘡,多器官硬化等發(fā)病率更高。,,,,造血干細(xì)胞移植存在的問題,移植后造血恢復(fù)緩慢,移植物抗宿主病(graft-versus-host,disease, GVHD)

42、是骨髓移植(BMT)后出現(xiàn)的,多系統(tǒng)損害(皮膚、食管、胃腸、肝臟等)的全身性疾病，是造成死亡的重要原因之一。,,,,間質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用,促進(jìn)造血和免疫功能重建治療GVHD,心腦血管疾病免疫系統(tǒng)疾病,,,,間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的優(yōu)點(diǎn),間質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中就是造血干細(xì)胞的支持細(xì)胞,MSC的低免疫原性,MSC的免疫調(diào)節(jié)作用，降低免疫應(yīng)答MSC誘導(dǎo)免疫耐受,MSC表達(dá)多種趨化因子受體，體內(nèi)可趨化遷移,到受損組織和器官,,,,間質(zhì)干

43、細(xì)胞促進(jìn)造血恢復(fù)和免疫重建，降低GVHD,前期動(dòng)物試驗(yàn)顯示:,1. MSC促進(jìn)受體鼠的外周血白細(xì)胞、血小板、淋,巴細(xì)胞的明顯恢復(fù)；,2. 幫助胸腺、脾臟的結(jié)構(gòu)重建，加速T細(xì)胞恢復(fù)3. 降低GVHD的發(fā)生率及嚴(yán)重程度,,,,MSC治療慢性GVHD的臨床試用MSC治療難治性cGVHD的臨床試用治療慢性GVHD病人10例，其中7例病人的口腔潰瘍、皮疹、肝功能異常、關(guān)節(jié)酸痛等癥狀有明顯好轉(zhuǎn)。MSCs輸

44、注量:,異體MSCs數(shù)自體MSCs數(shù)臍血輸注量：有核細(xì)胞CD34+細(xì)胞,4×106/kg8×106/kg6 ×107/kg5×105/kg,,,,MSC輸注對(duì)移植物抗宿主病的療效,,,,間質(zhì)干細(xì)胞的其他臨床應(yīng)用,缺血性心臟病，如心肌梗死,缺血性腦病，如腦梗死，缺血缺氧性腦病肝臟疾病，如肝纖維化腎臟疾病，如急性腎衰,,,,組織工程應(yīng)用,

45、納米材料：,成骨誘導(dǎo)，表面結(jié)合DEX-Vc,,,與納米材料結(jié)合軟骨細(xì)胞,,,,組織工程存在的問題,細(xì)胞和材料的相容性問題細(xì)胞對(duì)材料表面的要求材料的生物安全性,細(xì)胞來(lái)源安全性問題組織生長(zhǎng)的調(diào)控,細(xì)胞在材料內(nèi)部的功能性恢復(fù),臨床使用上面的相容性問題,,,,良好的生物材料的要求,1、生物相容性：組成和結(jié)構(gòu)與人體相應(yīng)組織相,似，無(wú)免疫排異原性，良好生物相容性及組織相容性，能與宿主組織愈合，誘導(dǎo)再生性修復(fù)。,2、生物力學(xué)順應(yīng)性：

46、滿足應(yīng)用場(chǎng)合的生物力學(xué),要求。,3、生物降解性：能按需要降解，做到隨再生組,織的生長(zhǎng)而作順應(yīng)性降解，使組織的生長(zhǎng)與材料降解同步。,4、材料表面或者材質(zhì)能夠植入后，在原位誘導(dǎo),組織再生。,,,,骨組織相容性的檢測(cè),,,,神經(jīng)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用,脊髓損傷,缺血性腦卒中,神經(jīng)元退行性病變，如ALS、帕金森病等,,,,胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用,無(wú)限增殖、多向分化潛能,目前還存在較多的問題，主要是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。目前關(guān)于胚胎干細(xì)胞治療相關(guān)動(dòng)物模

47、型的實(shí)驗(yàn)研究較多，如帕金森病等。,,,,胚胎干細(xì)胞其他應(yīng)用,建立胚胎干細(xì)胞的體外分化模型,建立各種基因改變的胚胎干細(xì)胞系, 以求發(fā)現(xiàn)某些基因或細(xì)胞因子在胚胎發(fā)育早期對(duì)不同類型細(xì)胞或組織分化的作用。,,利用新生（Postnatal,day 0）Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠研究證明多個(gè)臟器Nestin表達(dá)陽(yáng)性,,,,Sperm development defect of CDYL homozygotes F,,,,藥物篩選的

48、平臺(tái),新藥在臨床使用前需要進(jìn)行一系列的檢測(cè)和實(shí)驗(yàn),這些實(shí)驗(yàn)都依靠動(dòng)物來(lái)完成。,但是動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)不可能完全反映藥物對(duì)人體細(xì)胞的作用。,胚胎干細(xì)胞能模擬體內(nèi)細(xì)胞或組織對(duì)被檢測(cè)藥物的反應(yīng), 從而提供更安全、更有效、更經(jīng)濟(jì)的藥物篩選模型。,,干細(xì)胞凍存復(fù)蘇方案,賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司,,,,干細(xì)胞的凍存原理,在不加任何保護(hù)劑條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變

49、、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。,如向培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。,細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的-,5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。,干細(xì)胞凍存液的選擇,選擇一種省時(shí)高效、安全穩(wěn)定的凍存液，,是做好細(xì)胞凍存的關(guān)鍵！,,,,什么是NCR凍存液？,Non-Control Rate NCR,無(wú)控制

50、速率,就是降溫過程無(wú)需控制,,,,OriCellTM NCR凍存液研發(fā)機(jī)理,高山植物復(fù)活草耐過冰雪嚴(yán)寒仍能復(fù)活，某些昆蟲在高寒條件下可以不凍死；都是因?yàn)槠渥陨砗幸恍┍Ｗo(hù)物質(zhì)，能在極端環(huán)境下保護(hù)細(xì)胞不受損傷。,,,,OriCellTM NCR凍存液的研發(fā)機(jī)理,Cyagen團(tuán)隊(duì)模擬自然界這種神奇的自我保護(hù)能,力，在凍存液里添加了多種抗寒膜外保護(hù)劑、滲透性保護(hù)劑及沉降穩(wěn)定劑，使細(xì)胞在低溫環(huán)境下得到很好的保護(hù)。,,,,OriCell

51、TM NCR凍存液的作用機(jī)理,細(xì)胞膜保護(hù)劑---可在細(xì)胞膜外瞬間形成一層保護(hù)膜，保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞外冰晶的損害。,滲透性保護(hù)劑---可迅速滲透至細(xì)胞內(nèi)部，防止細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生大量冰晶，同時(shí)可保護(hù)細(xì)胞器，減少其在低溫下的損傷。,細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑---可平衡細(xì)胞沉降速度，防止細(xì)胞在凍存過程中聚集成團(tuán)。,,,,Oricell,TM,NCR-Cryopreservation medium,Oricell TM NCR-Cryopreser

52、vation10% DMSO inFBSControlNomal Cryo,,,,細(xì)胞復(fù)蘇率%,OricellTM NCR-Cryopreservation mediumNCR-Cryopreservation Medium10095908580757065605550,C57B

53、L/6,Balb/C,Wistar SD Rat,F344,Rabbit,Canine,Monkey C57BL/6,129,ICR MEF,MouseMSC,MouseMSC,Rat MSC,MSC,Rat MSC,MSC,MSC,MSC,MouseEsc,MouseEsc,細(xì)胞種類,,,,傳統(tǒng)細(xì)胞凍存液,大部分實(shí)驗(yàn)室會(huì)自制凍存液來(lái)凍存干細(xì)胞；,其缺點(diǎn)在于：,是需花大量資金購(gòu)買程序凍存儀器，或花上半天的時(shí)間去等待

54、細(xì)胞的程序降溫。,自制凍存液質(zhì)量不穩(wěn)定，批次間差異較大，容易造成細(xì)胞復(fù)蘇率低和實(shí)驗(yàn)的不可對(duì)比性。,新手未掌握凍存時(shí)間，在環(huán)境轉(zhuǎn)移過程中容易造成溫度波動(dòng)而損害細(xì)胞。,,,,Cyagen的無(wú)程序凍存液,無(wú)需程序降溫，-80℃一步凍存、無(wú)血清、無(wú)任何蛋白；高復(fù)蘇率>90%,不影響干細(xì)胞的特性；細(xì)胞增殖不改變、細(xì)胞,分化不改變；,容易使用、穩(wěn)定性高,可以直接使用，無(wú)需任何的操作,凍存過程中細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定，無(wú)溫度波動(dòng),干細(xì)胞的凍存

55、,凍存流程：,1、選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照常用的方法收集細(xì)胞于試管中，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。,2、離心收集的細(xì)胞（參考離心條件：4℃，250g，3-5分鐘），吸去上清液。,3、加入適當(dāng)?shù)膬龃嬉旱诫x心管，緩慢混合均勻，制成細(xì),胞混合液。細(xì)胞凍存濃度約為105～106Cells/ml。,4、將離心管中的細(xì)胞混合液分裝至已做標(biāo)識(shí)的凍存管。5、將分裝好細(xì)胞的凍存管直接放于-80℃冰箱，24h后可以移入-196℃液氮中長(zhǎng)期保存。,,,,干

56、細(xì)胞的復(fù)蘇,復(fù)蘇流程：,1、準(zhǔn)備好相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液，平衡至室溫；往離心管中加入6-8mL細(xì)胞培養(yǎng)液。準(zhǔn)備37℃水浴。,2、從-80℃冰箱或液氮取出凍存的細(xì)胞，迅速放入37℃水浴中快速晃動(dòng)，待凍存懸液完全溶解后，往凍存管中加入1mL細(xì)胞培養(yǎng)液，稍微吹打后立即將細(xì)胞混合液移入裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管中，混合均勻。,3、離心收集的細(xì)胞（離心條件可參考細(xì)胞凍存方法），盡量移去上清液。,4、加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，按各自實(shí)