乙酰膽堿酯酶的分離純化及固定化技術(shù)研究.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(AChE)是一種重要的生物功能物質(zhì)。它能夠選擇性地催化底物乙酰膽堿水解，且其催化活性能被有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥所抑制。利用這一特性，針對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留測(cè)定的膽堿酶抑制快速檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)越來(lái)越受到重視。但是，乙酰膽堿酯酶的來(lái)源問(wèn)題一直是困擾農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要因素。如果采用進(jìn)口酶源不但價(jià)格較昂貴，而且到貨周期較長(zhǎng)，難以滿足檢測(cè)過(guò)程的需求。此外，由于游離酶性質(zhì)不穩(wěn)定，極易失活，不能重復(fù)使用，只有固

2、定化酶才具有使用價(jià)值。本文主要對(duì)AChE的分離純化及固定化技術(shù)進(jìn)行了研究。 首先，本文以胎牛血清為乙酰膽堿酶源，對(duì)其進(jìn)行了分離純化技術(shù)研究。通過(guò)采用硫酸銨逐級(jí)沉淀、葡聚糖凝膠柱層析、DEAE纖維素柱層析三步分離純化過(guò)程，可得到單點(diǎn)純的乙酰膽堿酯酶，表現(xiàn)在凝膠電泳上即由硫酸銨沉淀液的4條譜帶減少至一條譜帶。 其次，本文對(duì)乙酰膽堿酯酶的固定化技術(shù)進(jìn)行了研究。采用交聯(lián)法對(duì)酶進(jìn)行固定是一種廣泛采用的固定化方法，本文對(duì)影響固化

3、乙酰膽堿酯酶活性的固定化條件，諸如pH值、BSA、GA、明膠的最佳使用濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)交聯(lián)法固定的乙酰膽堿酯酶，在室溫下放置6個(gè)月以后酶活性仍可保持60％以上。但是采用交聯(lián)法對(duì)酶進(jìn)行固定化過(guò)程中必須使用雙功能試劑戊二醛，此試劑本身會(huì)對(duì)乙酰膽堿酯酶的活性造成較大傷害，所以經(jīng)固定化以后酶的活力回收率較低。目前，一種光交聯(lián)試劑聚乙烯醇苯乙烯吡啶(PVA-SbQ)在酶的固定化過(guò)程中倍受青睞，本文在實(shí)驗(yàn)室合成出PVA-SbQ。經(jīng)PVA-Sb