極端酸性礦山廢水中微生物群落組成及多樣性.pdf

1、酸性礦山廢水(acid mine drainage，AMD)和酸化尾礦是極端酸性環(huán)境(pH<3)的典型代表。由于AMD微生物在環(huán)境基因組研究、礦業(yè)環(huán)境酸化機(jī)理及控制等方面具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義，因此有關(guān)AMD環(huán)境中微生物群落組成及系統(tǒng)發(fā)育多樣性的研究已經(jīng)成為當(dāng)前重要的研究熱點(diǎn)。然而，最近分子研究表明，目前科學(xué)界對AMD微生物的認(rèn)識仍然十分有限，而且許多有關(guān)嗜酸微生物功能群對產(chǎn)酸貢獻(xiàn)的認(rèn)識是片面甚至是錯誤的。特別地，在眾多AMD產(chǎn)生的重

2、要源頭當(dāng)中，尾礦的研究長期受到忽視，已有的認(rèn)識主要來自基于培養(yǎng)方法的研究。有鑒于此，本論文采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)與16S rRNA基因(rDNA)克隆文庫相結(jié)合的方法系統(tǒng)地研究了廣東樂昌鉛鋅尾礦AMD、尾礦以及云浮硫鐵礦露天采礦場AMD三個極端酸性環(huán)境中微生物群落的組成及多樣性，目的是了解這幾個典型AMD環(huán)境中微生物的多樣性，并探討對AMD產(chǎn)生起主要貢獻(xiàn)的微生物功能群的組成。主要研究內(nèi)容及結(jié)果概括如下： (1)樂昌尾礦AMD(pH

3、2.0)微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果表明，可培養(yǎng)的嗜酸微生物為氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)和嗜酸異養(yǎng)菌—Acidiphilium cryptum。然而，用16S rRNA方法卻揭示尾礦AMD捌有許多在系統(tǒng)發(fā)育上不同的微生物。文庫中檢測到7個細(xì)菌類群(目前在AMD中被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌類群總共有8個)，它們是Nitrospira、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、

4、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Firmieutes和Acidobacteria。在141個被分析的克隆子中，有104個(占整個文庫的73.8％)在系統(tǒng)發(fā)育上歸入到Leptospirillum屬類群Ⅲ(為新發(fā)現(xiàn)的具有鐵離子氧化能力的微生物類群)；30個在系統(tǒng)發(fā)育上屬于Proteobacteria，其中一半的克隆子(15個)與具有鐵離子還原能力的Alphaproteobacteria成員表現(xiàn)

5、十分相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其它的克隆子在系統(tǒng)關(guān)系上分布在Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria(各6個克隆子)和具有硫酸根和鐵還原能力的Deltaproteobacteria(3個克隆子)細(xì)菌類群內(nèi)；最后的4個克隆子分布在Firmicutes和Acidobacteria兩個類群，克隆子數(shù)分別為3和1個。文庫中大約一半的序列型(代表大部分的16S rDNA克隆子)歸入到目前僅有少數(shù)純培養(yǎng)或根本沒有純培養(yǎng)

6、而僅有環(huán)境序列的細(xì)菌類群內(nèi)。此外，文庫中發(fā)現(xiàn)一個新的序列型(LCAll6)。 (2)考慮到尾礦AMD中具有如此特殊的微生物群落(類群Ⅲ占優(yōu)勢)組成，我們進(jìn)一步對AMD產(chǎn)生的源頭一酸化尾礦(pH 1.9)中微生物的多樣性進(jìn)行了研究，以期對這兩個酸化環(huán)境中微生物的組成及結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。LIBSHUFF統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，尾礦與尾礦AMD之間微生物群落組成及多樣性存在明顯差異。尾礦中可培養(yǎng)的微生物包括At.ferrooxida

7、ns、Leptospirillum.ferriphilum和Suljobacillus montserratensis等自養(yǎng)鐵氧化細(xì)菌以及Acidiphilium cryptum嗜酸異養(yǎng)菌。16S rRNA克隆文庫分析結(jié)果表明，該環(huán)境微生物多樣性較低，在分析的142個克隆子中，絕大部分(135個克隆子)在系統(tǒng)發(fā)育上歸入到古細(xì)菌Thermoplasmales目，其中128個克隆子(占整個文庫的90％)與Ferroplasma．a(chǎn)cidip

8、hilum 16S rRNA基因序列的相似性達(dá)98.4-199.7％；4個克隆子也歸為Ferroplasma屬，它們在系統(tǒng)發(fā)育樹上最靠近的序列為不可培養(yǎng)的古細(xì)菌克隆子(ant h4，在西班牙Tinto River中被檢測到)，序列相似性為96.9％；其余3個古細(xì)菌克隆子在發(fā)育樹上分別位于Cplasma和Dplasma兩個分枝。分子方法也檢測到L.ferriphilum的存在。 (3)此外，我們還對云浮硫鐵礦露天采礦場AMD(pH

9、 2.6-2.9)中微生物群落組成、結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。采用木端限制性片段長度多態(tài)型分析方法(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)對不同季節(jié)和空間的七個AMD樣品(大塘AMD春夏秋冬的樣品分別用S4SPR、S4SUM、S4AUT和S4WIN表示；夏季大塘AMD四個不同位點(diǎn)的樣品分別用S1SUM、S2SUM、S3SUM和S4SUM表示)的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了

10、研究。結(jié)果表明，七個樣品(熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物)經(jīng)過內(nèi)切酶HaelII酶切后，經(jīng)測序儀檢測出來的限制性片段(T-RFs)在大小和數(shù)量上表現(xiàn)出明顯差異。主成分(PCA)和聚類分析將它們分成三個不同的組：第一組為S4SPR，第二組為S1SUM，第三組為S2SUM、S3SUM、S4SUM、S4AUT和S4WIN。在上述分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們對3個具有明顯微生物結(jié)構(gòu)差異的樣品(S4SPR、S4SUM和S1SUM)進(jìn)行了深入地系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析。

11、同樣地，LIBSHUFF分析表明，構(gòu)建的三個克隆文庫極不相似(P＜0.05)。在S4SPR文庫中，共檢測到20個序列型，其中一半的序列型在系統(tǒng)發(fā)育上分布在Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Nitrospira和Archaea四個類群，它們代表的克隆子占整個文庫的80％以上(分別為27.2％、20.8％、8.8％和26.4％)。這些序列型與其它AMD環(huán)境中的克隆子(Tui3-12、BA71、AS

12、6)及鐵氧化細(xì)菌(L ferrodiazotrophum UBAl)、鐵氧化古細(xì)菌(Ferroplasma acidiphilum)在系統(tǒng)關(guān)系上十分相近。此外還檢測到一些真核生物的序列(序列型為S4SPR-52)。在S4SUM文庫中，共檢測到19個序列型，其中14個在系統(tǒng)發(fā)育上歸入Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria和Deltaproteobacteria三個類群。文庫中相對豐度最高的類群為Gam

13、ma-proteobacteria，該類群的微生物占到整個文庫的50％，與氧化亞鐵硫桿菌(At．ferrooxidans)具有十分相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；其它的序列型主要與克隆子Tui3-12(屬于Betaproteobacteria)和AS6(屬于Deltaproteobacteria)表現(xiàn)出較高的序列相似性。與前兩個文庫不同，S1SUM文庫中數(shù)量上占優(yōu)勢的微生物類群為Betaproteobacteria。盡管檢測到的17個序列型中只有3

14、個在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上屬于此類群，但是它們代表的克隆子可以占到整個文庫的65.7％，主要與克隆子Tui3-12在系統(tǒng)關(guān)系上最為接近。接下來豐度較高的類群依次為Deltaproteobacteria、Nitrospira、候選門(包括TM7和WS6)和Archaea。上述三個AMD文庫中還檢測到8個新的序列型，它們分別是S4SPR-111、S4SUM-20、S4SUM-44、S4SUM-130、S4SUM-140、S1SUM-16、S1SUM

15、-19和S1SUM-105。由于這些序列型與已獲得的純培養(yǎng)或環(huán)境序列系統(tǒng)關(guān)系較遠(yuǎn)，它們可能代表新的物種。 本論文研究結(jié)果表明，三個典型AMD環(huán)境中微生物群落組成及多樣性明顯不同。由于在每個文庫中均檢測到大量與鐵離子氧化有關(guān)的微生物存在，這些微生物對AMD的產(chǎn)生有直接的貢獻(xiàn)。Leptospirillum屬類群Ⅲ所代表的微生物以及Fp.acidiphilum和L.ferriphilum可能是導(dǎo)致樂昌尾礦AMD產(chǎn)生的關(guān)鍵微生物類群；而