基于免疫PCR生物條形碼技術檢測多氯聯(lián)苯的研究.pdf

1、多氯聯(lián)苯（PCBs）是一類人工合成的有機氯化合物，它具有優(yōu)良的物理化學性質，曾經(jīng)廣泛的應用于工業(yè)生產(chǎn)中。雖然PCBs已經(jīng)被禁止使用了近40年，但仍能在環(huán)境的各個角落檢測到它的存在。PCBs在環(huán)境中難降解，并具有生物蓄積性和高毒性，給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了巨大的威脅。PCBs也因此成為各個國家和地區(qū)重點監(jiān)測的污染物之一。
　　目前檢測PCBs的主要方法為氣相色譜法，但該方法對樣品前處理要求苛刻，所需儀器價格昂貴，檢測成本高，檢測周

2、期長，不適合對樣品的快速高通量分析檢測。而免疫分析方法具有操作簡單、成本低、靈敏度高、能夠實現(xiàn)對目標分子的快速高通量分析檢測等優(yōu)點，目前已廣泛的用于環(huán)境污染物的分析檢測。因此，建立快速簡便的免疫分析方法來檢測PCBs具有重要的意義和廣闊的應用前景。
　　本文制備了三種分別針對PCB12、PCB37和PCB77的多克隆抗體和一種抗PCB37的單克隆抗體，在此基礎上建立了檢測PCB12、PCB37、PCB77的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（

3、ic-ELISA）；將制備的抗體進行生物素化處理，建立了檢測PCBs的生物素-親和素放大酶聯(lián)免疫吸附法（BA-ELISA）；將不同的抗體和DNA修飾在金納米顆粒（GNPs）表面，制備了多種抗體-GNPs-DNA探針，用于取代傳統(tǒng)免疫 PCR中的抗體-DNA結合物，基于這些探針，建立了基于實時熒光定量免疫PCR（rt-IPCR）的生物條形碼方法（BCA）來檢測環(huán)境中的PCBs。將這些方法用于實際環(huán)境樣品中PCBs的分析檢測，取得了滿意的結

4、果，為實現(xiàn)快速、高通量分析檢測環(huán)境中的PCBs提供了可靠的技術支撐。主要研究結果如下：
　?。?）以牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）為載體蛋白，分別用活化酯法和混合酸酐法制備了三種PCBs單體的人工免疫原和包被原，產(chǎn)物通過紫外光譜掃描分析確定半抗原與蛋白質成功偶聯(lián)；通過免疫新西蘭大白兔，制備了三種分別抗PCB12、抗PCB37和抗PCB77的多克隆抗體，所得的抗體特異性較好，效價較高，均能達到1:256000；本文還通過

5、免疫小鼠，細胞融合，雜交瘤細胞培養(yǎng)，采集腹水，制備了抗PCB37單克隆抗體，和多克隆抗體相比，該抗體對PCB37的特異性更好。
　　（2）利用所獲得的抗體，分別建立了檢測PCB12、PCB37和PCB77的ic-ELISA方法。優(yōu)化了抗原抗體濃度，溫育時間，封閉液，有機溶劑，鹽離子強度，pH值等實驗條件，在最佳實驗條件下，分別建立了檢測PCB12、PCB37和PCB77的標準曲線；基于多克隆抗體，該方法對這三種PCBs單體的LOD

6、分別為0.016μg L-1、0.048μg L-1、0.063μg L-1。基于單克隆抗體，該方法對PCB37的LOD為0.027μg L-1；將該方法用于海底沉積物樣品中PCBs的分析檢測，回收率均在81％-115%的范圍內(nèi)，變異系數(shù)（CV）均小于15%。
　　（3）將抗體進行生物素化預處理，利用生物素-親和素生物系統(tǒng)，分別建立了檢測PCB12、PCB37和PCB77的BA-ELISA方法。優(yōu)化了包被原及生物素化抗體濃度，SA

7、-HRP濃度，抗原抗體反應時間，生物素化抗體與SA-HRP反應時間等實驗條件，同時還討論了有機溶劑濃度，反應介質中pH值及鹽離子濃度對實驗的影響；在最佳實驗條件下，分別建立了檢測PCB12、PCB37和PCB77的標準曲線；基于多克隆抗體，該方法檢測PCB12、PCB37和PCB77的IC50分別為0.53μg L-1，0.68μg L-1，1.36μg L-1；LOD分別為4.5 ng L-1、17 ng L-1、18 ng L-1；

8、基于單克隆抗體，該方法檢測PCB37的IC50為0.27μg L-1，LOD8 ng L-1；將建立的方法用于帶魚樣品中 PCBs的分析檢測，加標樣品中 PCB12、PCB37和PCB77的回收率均在81%-113%之間，CV均小于15%。
　　（4）分別用羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG及DNA修飾15 nm的GNPs，制備了羊抗兔IgG-GNPs-DNA和羊抗小鼠IgG-GNPs-DNA兩種GNPs探針，用紫外掃描光譜和透射電鏡（

9、TEM）對其表征，確定抗體和DNA修飾在GNPs表面。
　　基于這兩種GNPs探針，分別建立了檢測PCB12、PCB37、PCB77和Aroclor1248的基于rt-IPCR的間接BCA方法。該方法將包被原包被在戊二醛預處理過的 PCR管上，讓其和樣品中的目標分子競爭抗體，與包被原結合的抗體保留在PCR管內(nèi)，然后通過抗體與GNPs探針表面的二抗結合，使得部分GNPs探針附著在PCR管內(nèi)，其他GNPs探針則通過洗滌去除，在實時熒光

10、定量PCR擴增階段，條形碼DNA從GNPs探針表面釋放到PCR管內(nèi)，并作為模板DNA直接參與PCR擴增，通過測定條形碼DNA的量來間接檢測樣品中PCBs的含量。
　　優(yōu)化了退火溫度，引物濃度，抗原抗體濃度，封閉液，GNPs探針濃度，抗體與 GNPs探針反應時間等實驗條件；在最佳實驗條件下，基于羊抗兔 IgG-GNPs-DNA探針和抗PCB12、抗PCB37、抗PCB77、抗Aroclor1248四種多克隆抗體，分別建立了檢測PCB

11、12、PCB37、PCB77、Aroclor1248的標準曲線，其檢測下限分別為2.63 pg L-1，4.35 pg L-1，1.72 pg L-1，10.20 pg L-1?；谘蚩剐∈驣gG-GNPs-DNA探針和抗PCB37單克隆抗體，該方法檢測PCB37的LOD為2.03 pg L-1。將建立的方法用于小黃魚樣品中PCBs的分析檢測，加標樣品的回收率均在81%-112%之間，CV均小于15%。
　?。?）分別用不同的抗體

12、和DNA修飾15 nm的GNPs，制備了五種GNPs探針，抗PCB12抗體-GNPs-DNA，抗PCB37多抗-GNPs-DNA，抗PCB37單抗-GNPs-DNA，抗PCB77抗體-GNPs-DNA和抗Aroclor1248抗體-GNPs-DNA，分別用紫外掃描光譜和TEM對其表征，確?？贵w和DNA修飾在GNPs表面；
　　基于這五種GNPs探針，分別建立了檢測PCB12、PCB37、PCB77和Aroclor1248的基于rt

13、-IPCR的直接競爭BCA方法。該方法將包被原包被在戊二醛預處理過的PCR管上，讓其和樣品中的目標分子競爭GNPs探針上的抗體，一部分GNPs通過包被原與抗體的特異性結合附著在PCR管內(nèi)，其他GNPs探針則通過洗滌去除，在實時熒光定量PCR擴增階段，條形碼DNA從GNPs探針表面釋放PCR管內(nèi)，并作為模板DNA直接參與PCR擴增，通過測定條形碼DNA的量來間接檢測樣品中PCBs的含量。
　　優(yōu)化了金納米探針濃度，封閉液，抗原抗體反

14、應時間，有機溶劑濃度，反應介質中鹽離子強度，pH值等條件，并在最佳實驗條件下，分別建立了檢測不同目標分子的標準曲線。該方法檢測PCB12、PCB77、Aroclor1248的檢測下限分別為4.36 pg L-1，9.12 pg L-1，2.55 pg L-1；基于多克隆抗體和單克隆抗體，該方法檢測PCB37的檢測下限分別為4.64 pg L-1，3.15 pg L-1；將建立的方法用于帶魚樣品中PCBs的分析檢測，加標樣品回收率均在81