紅樹林沉積物中磺胺間甲氧嘧啶(SMMX)降解菌的篩選及其降解性能研究.pdf

1、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMMX）屬于廣譜、高效和高選擇性的磺胺類抗生素，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的細(xì)菌、真菌或原生生物引起的感染疾病治療。市政廢水排放入海和海水養(yǎng)殖用藥，造成抗生素類藥物在包括紅樹林在內(nèi)的濱海濕地藥物殘留，可能削弱微生物的分解作用從而降低生態(tài)系統(tǒng)的功能。本文采集了湛江觀海長廊人工紅樹林區(qū)的沉積物樣品，以篩選SMMX為單一碳源的抗生素降解細(xì)菌為目標(biāo)，采用馴化方法篩選到了6株具有降解

2、潛力的初篩菌株，運(yùn)用經(jīng)典和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法對(duì)降解菌株進(jìn)行了系統(tǒng)分類鑒定，同時(shí)采用超高效液相色譜儀(UPLC)檢測方法結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)研究了降解菌株（Aeromonascaviae，HA-J1）對(duì)SMMX的生物降解性能，以獲得最優(yōu)降解條件，為后續(xù)構(gòu)建生物修復(fù)工程菌株奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　1、應(yīng)用搖瓶富集馴化的方法，通過熒光顯微計(jì)數(shù)法測定馴化菌株在培養(yǎng)前后的數(shù)量變化，從湛江觀海長廊人工紅樹林區(qū)的沉積物樣品篩選分

3、離到6株以獸藥SMMX抗生素為單一碳源的初篩菌株，分別編號(hào)為HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA J7、HA-J8和HA-J9。在相同培養(yǎng)條件下，隨獸藥濃度的增大6株菌的數(shù)量先增加后減少，在800mg/L時(shí)，生長最適宜。通過生長曲線測定，菌株在15～24h處于生長旺盛的階段，可以作為測定生物降解量末端的合適取樣時(shí)間。
　　2、根據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和細(xì)菌16s rDNA擴(kuò)增對(duì)6株SMMX降解菌進(jìn)行了系統(tǒng)分類鑒定，結(jié)果

4、表明，HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J8為氣單胞菌屬（Aeromonas），HA-J7、HA-J9為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，再分別通過看家基因gyrB/gyrA基因進(jìn)一步鑒定，結(jié)果表明HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J8為豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae），HA-J7、HA-J9為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）。
　　3、通過在無機(jī)鹽培養(yǎng)液中添加色譜純S

5、MMX室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)研究6株降解菌進(jìn)行濃度遞增復(fù)篩，采用UPLC測定降解菌培養(yǎng)前后的SMMX的降解率，結(jié)合熒光顯微鏡測定培養(yǎng)前后SMMX降解菌的數(shù)量變化，獲得復(fù)篩結(jié)果，6株菌HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J7、HA-J8與HA-J9的有效生物降解率依次為24.13％、6.8％、1.4％、4％、13％、3.75％，由此將HA-J1菌株確定為SMMX高效生物降解菌株。通過Pearson相關(guān)性分析6株初篩菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶降解率與降

6、解前后細(xì)菌的增量，發(fā)現(xiàn)相關(guān)性不顯著(p＞0.05)。
　　4、通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)測定了HA-J1菌株在不同pH值、溫度、鹽度、SMMX濃度的四因素五水平的25組實(shí)驗(yàn)組合條件下對(duì)SMMX降解率及降解菌數(shù)量變化，獲得HA-J1菌株最優(yōu)降解條件組合為溫度25℃、pH5、鹽度為15、抗生素濃度為200mg/L，最優(yōu)組合條件下的生物降解率達(dá)14.47％。多因素方差分析結(jié)果顯示各因素間無顯著性差異(p＞0.05)。通過Pearson相關(guān)性分析，

7、發(fā)現(xiàn)各組合下的降解率與降解前后的細(xì)菌增量有顯著的正相關(guān)(r=0.735，p＜0.05)。在最優(yōu)正交組合下測定細(xì)菌最佳接種量為16％，降解率為19.29％。
　　5、為探討降解菌株對(duì)其他磺胺類藥物的降解性能，研究了6株初篩菌株在相同培養(yǎng)條件下分別在以100mg/L的磺胺間甲氧嘧啶(SMMX)和磺胺甲噁唑(SMX)為單一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中的生物降解效率，HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J7、HA-J8與HA-J9對(duì)SMMX

8、的有效生物降解率依次為14.11％、1.55％、1.47％、4.87％、8.49％、3.33％，對(duì)SMX的生物降解率分別為0.64％、0.32％、0.47％、0.45％、0.14％。配對(duì)T檢驗(yàn)結(jié)果表明，降解菌對(duì)SMX的降解率顯著低于其對(duì)SMMX的降解率(p＜0.05)。
　　6、研究了添加100mg/L的葡萄糖、甲醇、蔗糖等不同碳源后高效降解菌株HA-J1對(duì)相同質(zhì)量體積濃度SMMX抗生素(即也為100mg/L)的降解率，結(jié)果表明，

9、添加葡萄糖、甲醇、蔗糖這三種碳源后的降解效率依次分別為23.02％、18.36％、14.61％，無外加碳源的對(duì)照組降解率為13.45％。添加外加碳源不同程度的提高了高效降解菌株對(duì)SMMX的降解率，但兩者之間無顯著差異(ANOVA，p＞0.05)。
　　本文的研究結(jié)果表明從紅樹林區(qū)沉積物中可以篩選得到高效降解磺胺類藥物磺胺間甲氧嘧啶的單一菌株，并鑒定為豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，但其降解功能基因及降解途徑尚不清