枯草芽孢桿菌基因修飾及木糖發(fā)酵生產(chǎn)核黃素的研究.pdf

1、核黃素是重要的B族維生素之一，作為醫(yī)藥、動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和食物添加劑而具有普遍的應(yīng)用。本文以提高核黃素發(fā)酵菌株的生產(chǎn)性能為目的，研究了枯草芽孢桿菌中核黃素合成途徑及木糖代謝途徑相關(guān)基因的遺傳修飾，對(duì)核黃素發(fā)酵的影響；也考察了木糖/蔗糖共代謝進(jìn)行核黃素發(fā)酵的可行性。
　　在枯草芽孢桿菌LX34的ribC基因編碼區(qū)中引入G596A堿基突變，構(gòu)建了重組菌LXZ-1。發(fā)酵結(jié)果顯示，G596A點(diǎn)突變使核黃素產(chǎn)量提高到0.24 g/L，相比

2、于在該基因啟動(dòng)子區(qū)域引入堿基突變（-35區(qū)，T→C）的菌株LX36，產(chǎn)量提高了50％。而且啟動(dòng)子-35區(qū)點(diǎn)突變與G596A突變不能同時(shí)存在。
　　在LXZ-1菌株中過表達(dá)了ribA基因，得到重組菌株LXZ-2，核黃素產(chǎn)量提高到0.48 g/L，但會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞自溶現(xiàn)象。共表達(dá)ribA-ribH基因所構(gòu)建的LXZ-3菌株，核黃素產(chǎn)量提高到0.9 g/L，且細(xì)胞自溶現(xiàn)象消失。共表達(dá)ribA-ribD基因的重組菌不能構(gòu)建。共表達(dá)ribA-r

3、ibE基因的重組菌，核黃素產(chǎn)量與出發(fā)菌相比基本保持不變。結(jié)果表明，核黃素合成途徑的中間代謝物合成5-氨基-6-(5'-磷酸核糖氨基)尿嘧啶可能具有細(xì)胞毒性。
　　與其它碳源相比，木糖作為碳源時(shí)核黃素產(chǎn)量最高，但生物量有所降低；當(dāng)以木糖/蔗糖作為混合碳源進(jìn)行共代謝發(fā)酵時(shí)生物量水平基本保持正常，核黃素產(chǎn)量進(jìn)一步提高。結(jié)果說明，蔗糖與木糖共代謝，能夠改善前體物5-磷酸核酮糖供給，是進(jìn)一步促進(jìn)核黃素高產(chǎn)及收率的有效手段。
　　以B.

4、 subtilis LXZ-3為出發(fā)菌，在染色體上整合過表達(dá)對(duì)木糖運(yùn)輸?shù)鞍拙幋a基因araE、表異構(gòu)酶編碼基因rpe以及原位組成型表達(dá)木糖操縱子xyl分別構(gòu)建了重組菌B. Subtilis LXZ-4、LXZ-5、LXZ-6。相比于出發(fā)菌，核黃素在這些重組菌的搖瓶發(fā)酵中產(chǎn)量都顯著降低。結(jié)果表明，在調(diào)節(jié)蛋白AraR缺失的前提下，以木糖作為主要碳源，B. subtilis固有的木糖吸收和代謝能力不再是限制因素來制約核黃素過量合成。