表面展示亞油酸異構(gòu)酶的重組植物乳桿菌構(gòu)建及其高效合成共軛亞油酸.pdf

1、共軛亞油酸(Conjiugated linoleic acid,CLA)是亞油酸(Linoleic acid,LA)的一組位置和構(gòu)象異構(gòu)體的總稱,近年來,大量研究報(bào)道CLA具有抗癌、抗動(dòng)脈硬化癥、減肥、提高機(jī)體免疫等功效,引起了人們對(duì)CLA研究的極大關(guān)注。本文從菌株分離篩選出發(fā),對(duì)分離所得菌株合成CLA的能力進(jìn)行檢測(cè):對(duì)高產(chǎn)CLA菌株進(jìn)行鑒定以及誘變選育,并對(duì)篩選得到的誘變高產(chǎn)菌株進(jìn)行LA耐性以及產(chǎn)物CLA異構(gòu)體的分析和檢測(cè);隨后通過對(duì)

2、CLA合成過程中的關(guān)鍵酶——亞油酸異構(gòu)酶(Linoleic acid isomerase,LAI)基因的擴(kuò)增和分析以及在酵母表面展示表達(dá)來探討CLA合成的機(jī)理;通過將LAI在植物乳桿菌表面展示表達(dá)來構(gòu)建基因工程菌株,以期增加CLA產(chǎn)量。論文的主要研究結(jié)果如下:
　　 采用梯度稀釋法從三種不同的泡菜中篩選得到乳酸菌78株以及實(shí)驗(yàn)室保存菌株8株,共有出發(fā)菌株86株菌。通過紫外分光光度法,對(duì)所有菌株轉(zhuǎn)化合成CLA能力檢測(cè)得知,45株茵

3、具有合成CLA的能力(其中43株菌分離自泡菜)。其中菌株Ip15合成CLA能力最高,在添加O.1 mg/ml LA,1％接種量,30℃靜置培養(yǎng)24 h時(shí),CIA含量為26.1μg/mt,轉(zhuǎn)化率達(dá)26.1％;經(jīng)過細(xì)胞形態(tài)、生理生化測(cè)定、API系統(tǒng)以及16S Rdna分子鑒定,結(jié)果為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。
　　 利用紫外線以及硫酸二乙酯(Diethyl sulfate,DES)對(duì)植物乳桿菌Ip1

4、5進(jìn)行誘變,通過不同誘變條件與誘變致死率的關(guān)系曲線確定最佳紫外及DES誘變條件為:紫外線照射距離30 cm,紫外誘變時(shí)間20 s(致死率約70％);DES誘變濃度1％,時(shí)間30 min或者DES誘變濃度2％,時(shí)間20 min(致死率約70％)。誘變得到多株正向突變菌株,CIA的生成能力較出發(fā)菌株提高幅度在1O.7％～52.2％。其中突變菌株Ip15-2-1CLA生成能力提高幅度最大,達(dá)到52.2％,且1O次傳代過程中,CLA產(chǎn)量基本保持

5、穩(wěn)定,表明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 不同濃度LA對(duì)菌株Ip15-2-1生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)表明,該菌株能夠耐受高達(dá)600lag/Ml LA,在1000μg/Ml LA濃度下依然能夠生長(zhǎng),但受一定影響;對(duì)菌株生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成CLA的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,使用優(yōu)化后的反應(yīng)條件測(cè)定得知,在添加200μg/Ml的MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h,CLA產(chǎn)量達(dá)48.7μg/Ml,添加不同濃度LA后(50、100、200、600、1000μg/Ml

6、),CLA產(chǎn)量分別為12.8、26.1、48.7、141.8、72.2μg/Ml;氣相色譜分析結(jié)果表明Ip15-2-1菌株產(chǎn)物CLA中包含兩種異構(gòu)體,其中異構(gòu)體c9t11-CLA約占76.5％,tiocl2-CLA約占23.5％。
　　 從植物乳桿菌Ip15-2-1中擴(kuò)增得到Jlai基因,序列全長(zhǎng)1695 bp,編碼565 aa。編碼序列Blast結(jié)果表明,LAI與肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原(Myosin cross.reactive

7、antigen,MCRA)蛋白家族成員同源性較高,而該序列與不同來源的LAI序列同源性則較低,比如與來源于紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis),嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus),羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri),短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)的LAI序列同源性分別為52.71％、27.56％、26.85％、25.9％,而與痤瘡丙

8、酸桿菌(Propionibacterium aches)中的PAI序列同源性僅為11.09％。此外通過比對(duì)發(fā)現(xiàn),與PAI中保守的FAD結(jié)合基序不同(GxGxxG(x)17-19E),植物乳桿菌Ip15-2-1中LAI的N端含有一個(gè)半保守的黃素腺嘌呤二核苷酸(Fiavin adenine dinucleotide,FAD)結(jié)合基序(GxGxxN(x)15K/D/E)。
　　 從釀酒酵母K601中分別擴(kuò)增了mfal信號(hào)肽序列以及α-

9、凝集素的C-末端321個(gè)氨基酸的編碼序列(sag),融合lai基因后插入酵母誘導(dǎo)型表達(dá)載體Pyes2中,構(gòu)建了酵母展示表達(dá)載體Pyes2-mfal-lai-sag(Pymls),通過電擊法轉(zhuǎn)化后獲得了展示表達(dá)LAI的酵母工程菌株;對(duì)酵母工程菌株不同組分的酶活測(cè)定表明LAI已成功在酵母細(xì)胞表面表達(dá),酶活最高達(dá)到40.5 U/ml,經(jīng)氣相色譜檢測(cè)表明,重組酵母菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物CLA中只有c9t11-CLA異構(gòu)體。
　　 將從乳酸乳球菌中