綠僵菌雙功能過氧化氫酶過氧化物酶基因MaKatG1的克隆與功能分析.pdf

1、綠僵菌(Metarhizium acridum)是一類重要的昆蟲病原真菌，在生物防治中起到重要的作用。它具有通過宿主體壁侵染害蟲這種獨特的侵染方式，因此在防治刺吸式口器害蟲中具有廣泛的應(yīng)用價值。綠僵菌孢子粘附到昆蟲體壁后，在適宜的條件下會形成附著胞這種侵染器官，然后穿透體壁，進入血淋巴，最終致死昆蟲。真菌體表侵染階段決定著是否能侵染以及侵染快慢，因此對這一時期綠僵菌的致病機制進行研究，可以為提高真菌殺蟲劑的效率提供依據(jù)。我們課題組構(gòu)建了

2、綠僵菌在附著胞形成階段均一化cDNA文庫，在已知基因組序列的基礎(chǔ)上，我們克隆得到了綠僵菌雙功能過氧化氫酶過氧化物酶基因MaKatG1，并采用基因敲除技術(shù)對其功能進行分析。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.MaKatG1的克隆與序列分析
　　 我們根據(jù)已知的綠僵菌基因組序列，克隆得到了雙功能過氧化氫酶過氧化物酶基因并將其命名為MaKatG1，Genbank登錄號為JN935023。該基因不含內(nèi)含子，其開放閱讀框

3、為2205bp，編碼一個含有734個氨基酸的蛋白。使用在線工具預(yù)測該基因的分子量為81kDa，理論等電點為5.88，而且不含信號肽。BLAST分析和進化樹分析發(fā)現(xiàn)，綠僵菌的雙功能過氧化氫酶過氧化物酶基因與其他真菌的過氧化氫酶過氧化物酶基因具有較高的同源性。
　　 2.采用基因敲除的方法對MaKatG1的功能進行分析
　　 為了研究該基因的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了MaKatG1的敲除載體pK2-pB-KatG1，通過農(nóng)桿菌介

4、導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將該載體轉(zhuǎn)入到綠僵菌CQMa102菌株，對篩選得到轉(zhuǎn)化子采用PCR分析和Southern blotting的方法進行驗證，最終得到2個轉(zhuǎn)化子菌株。
　　 3.MaKatG1，與綠僵菌的抗氧化能力有關(guān)
　　 分別將野生型菌株和敲除菌株接種到含有過氧化氫和甲萘醌的PDA平板，觀察菌株在氧化條件下的生長表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失MaKatG1這個基因后，菌株的生長受到明顯抑制，并且隨著氧化劑濃度的升高，這種抑制更明顯。過

5、氧化氫的毒性測試發(fā)現(xiàn)，野生型菌株的半致死劑量為6.3mM，而敲除菌株僅為1.8mM。
　　 4.MaKatG1編碼的蛋白具有過氧化氫酶和過氧化物酶活性
　　 我們檢測了敲除菌株以及野生型菌株的過氧化氫酶酶活和過氧化物酶酶活，發(fā)現(xiàn)敲除菌株的過氧化氫酶酶活和過氧化物酶酶活明顯低于野生型菌株，在氧化條件下，這種差異更加明顯。
　　 5.MaKatG1影響綠僵菌的毒力
　　 我們對野生型菌株和敲除菌株進行了生物學(xué)

6、毒力測定，采用注射的方式侵染蝗蟲，野生型菌株和敲除菌株的半致死時間沒有明顯差異，但是采用點滴侵染的方式侵染蝗蟲，敲除菌株的半致死時間顯著長于野生型菌株。結(jié)果說明該基因很有可能在侵染前期起作用。
　　 6.MaKatG1影響綠僵菌穿透體壁的能力
　　 用敲除菌株和野生型菌株分別采用點滴和注射的方式，對蝗蟲進行侵染后，定時取血淋巴觀察蟲菌體的數(shù)量。實驗發(fā)現(xiàn)，如果用注射的侵染方式，兩種菌株侵染后蝗蟲血淋巴的蟲菌體數(shù)量基本沒差異

7、，但是用點滴侵染時，敲除菌株侵染的蝗蟲血淋巴的蟲菌體數(shù)量明顯低于用野生型菌株侵染的蝗蟲血淋巴的蟲菌體數(shù)量。
　　 7.MaKatG1影響綠僵菌在活體蝗蟲體表的萌發(fā)和附著胞形成
　　 我們將敲除菌株和野生型菌株的新鮮孢子分別接種到活體蝗蟲翅膀和疏水性塑料表面，觀察孢子的萌發(fā)率和附著胞形成率。在蝗蟲翅膀，接種后18小時，敲除菌株的萌發(fā)率顯著低于野生型菌株；接種后24小時，敲除菌株的附著胞形成率顯著低于野生型菌株。但是在疏水性